發布時間：2022/07/15 點擊數：333 胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)移(yi)植為Ⅰ型糖(tang)尿病患者提供(gong)了一(yi)種特異(yi)性微創治(zhi)療方法，幫助患者有(you)效的(de)(de)(de)恢復正(zheng)常血糖(tang)和擺脫胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)素(su)(su)依賴。一(yi)般而言胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)移(yi)植的(de)(de)(de)臨床適(shi)用性受(shou)到(dao)胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)復雜(za)解離(li)過程的(de)(de)(de)限制，特別(bie)是胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)產量(liang)的(de)(de)(de)提高(gao)是胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)移(yi)植成功率提高(gao)的(de)(de)(de)關(guan)鍵。據相(xiang)關(guan)文(wen)獻（文(wen)獻1）證明胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)解離(li)用的(de)(de)(de)膠原(yuan)酶是影(ying)響胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)產量(liang)的(de)(de)(de)一(yi)個關(guan)鍵因素(su)(su)，可能會影(ying)響胰(yi)(yi)(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)臨床結(jie)果。
市(shi)面上(shang)也有(you)高度純化的(de)(de)(de)(de)膠(jiao)原酶(mei)(mei)產(chan)(chan)品，曾并(bing)被發現解離胰腺組(zu)織(zhi)非(fei)常(chang)有(you)效，但這些膠(jiao)原酶(mei)(mei)是一般(ban)使用(yong)牛(niu)的(de)(de)(de)(de)神(shen)經組(zu)織(zhi)和其(qi)他(ta)特定風險(xian)材(cai)料(liao)制造的(de)(de)(de)(de)，存在牛(niu)海(hai)綿狀腦病(bing)的(de)(de)(de)(de)潛在傳播風險(xian)，因而關于胰島移(yi)植的(de)(de)(de)(de)臨床應用(yong)被限制。現在被眾(zhong)多(duo)國際糖尿病(bing)治(zhi)療研究的(de)(de)(de)(de)臨床中(zhong)心使用(yong)的(de)(de)(de)(de)是一種GMP級膠(jiao)原酶(mei)(mei)(膠(jiao)原酶(mei)(mei)NB1)和GMP中(zhong)性蛋白酶(mei)(mei)(中(zhong)性蛋白酶(mei)(mei)NB)組(zu)合的(de)(de)(de)(de)胰島移(yi)植膠(jiao)原酶(mei)(mei)方案。該(gai)組(zu)合膠(jiao)原酶(mei)(mei)方案不含(han)牛(niu)神(shen)經組(zu)織(zhi)污染物或其(qi)他(ta)指定的(de)(de)(de)(de)風險(xian)原材(cai)料(liao)物質，且(qie)大量數據文獻分析已(yi)證明(ming)，該(gai)產(chan)(chan)品的(de)(de)(de)(de)活性與市(shi)面其(qi)他(ta)非(fei)臨床適用(yong)的(de)(de)(de)(de)膠(jiao)原酶(mei)(mei)產(chan)(chan)品相似(si)，從而從解離功能和安全性上(shang)都符(fu)合臨床級胰島移(yi)植的(de)(de)(de)(de)應用(yong)。
本次小編分(fen)享的(de)(de)是加州大學(xue)舊金山分(fen)校的(de)(de)研究者們利用這種(zhong)膠(jiao)原(yuan)酶組合進行(xing)胰(yi)島解離獲得適合移植(zhi)的(de)(de)高(gao)質量胰(yi)島的(de)(de)實驗過程和結(jie)果(guo)。
圖1 本(ben)次研究得到了美國(guo)青少年糖尿病(bing)研究基金會和美國(guo)國(guo)立衛生(sheng)研究院資助
1、胰腺捐贈(zeng)者篩選
一(yi)直(zhi)以(yi)(yi)來胰(yi)腺組(zu)織的(de)(de)供體大(da)小是一(yi)個重要的(de)(de)考(kao)慮因(yin)素，根(gen)據已(yi)有(you)經驗研究者篩選來自于體重超過90公斤、身(shen)高超過180厘米的(de)(de)男性捐贈(zeng)者的(de)(de)胰(yi)腺組(zu)織。此外(wai)如(ru)表1所示(shi)Nordmark（Serva）組(zu)合酶(mei)(mei)的(de)(de)胰(yi)島解離(li)方案(an)針(zhen)對(dui)的(de)(de)捐贈(zeng)者的(de)(de)年齡階段（＜45歲(sui)）相對(dui)市(shi)面上(shang)其他膠原酶(mei)(mei)產品(pin)（小于32歲(sui)）更為寬泛（表1），這可能與Nordmark組(zu)合酶(mei)(mei)中使(shi)用中性蛋白酶(mei)(mei)代替嗜熱菌蛋白酶(mei)(mei)以(yi)(yi)及相對(dui)較(jiao)低水(shui)平的(de)(de)類胰(yi)蛋白酶(mei)(mei)活性有(you)關（文獻(xian)2）。
表1 兩組膠原酶對比實驗中用(yong)于胰島移植的捐贈者(zhe)的特征
2、胰腺組(zu)織消化(hua)實(shi)驗
圖 2 Ricordi Chamber以及其中(zhong)初步(bu)解離的胰島樣本(ben)
所有(you)用于臨床(chuang)胰島(dao)移植(zhi)的(de)胰腺都(dou)由(you)研究者自己的(de)移植(zhi)研究員(yuan)從實(shi)體器官移植(zhi)官方已認證(zheng)的(de)胰腺采購(gou)(gou)渠道購(gou)(gou)買，胰腺組(zu)織在醫(yi)院從人體切割下(xia)來(lai)立即浸泡在威斯康(kang)星大學保(bao)存液(UW液)中，隨即送往胰島(dao)處(chu)理實(shi)驗(yan)室（符合聯邦法規的(de)GMP級(ji)設施）處(chu)理。處(chu)理過程時首(shou)先在胰管(guan)孔位置插管(guan)，利用壓力傳感(gan)器和泵以可控的(de)方式操控胰腺擴張(zhang)，然后將組(zu)織切成碎片，放入(ru)Ricordi Chamber（如(ru)圖2左）。
胰(yi)(yi)腺消(xiao)化過(guo)程(cheng)主要包(bao)括為：消(xiao)化溶(rong)液的(de)(de)溫度(du)在(zai)5分(fen)鐘內(nei)提(ti)高到(dao)37°C，然(ran)后(hou)處理消(xiao)化時間控(kong)制在(zai)15分(fen)鐘之內(nei)。當2 mL的(de)(de)分(fen)裝(zhuang)樣本中(zhong)出現超過(guo)40個胰(yi)(yi)島時停止消(xiao)化停止（圖2右），同時有游離胰(yi)(yi)島和內(nei)嵌的(de)(de)胰(yi)(yi)島，腺泡(pao)組織大小(xiao)小(xiao)于(yu)300μm。停止消(xiao)化的(de)(de)決定是由同一個人(ren)在(zai)每(mei)次消(xiao)化期間做出的(de)(de)。消(xiao)化時間和停止標(biao)準與同組的(de)(de)其他膠原酶一致。用室溫RPMI沖洗Chamber將溫度(du)降至30℃即可停止消(xiao)化。消(xiao)化物被迅速收集到(dao)含有冷RPMI、人(ren)血(xue)清白(bai)蛋白(bai)、胰(yi)(yi)島素(su)和肝素(su)的(de)(de)燒瓶中(zhong)，然(ran)后(hou)離心。然(ran)后(hou)將上(shang)述組織微球混合物在(zai)含有2%五聚(ju)淀粉、人(ren)血(xue)清白(bai)蛋白(bai)肝素(su)和血(xue)清胰(yi)(yi)島素(su)的(de)(de)冷藏溶(rong)液中(zhong)。淀粉的(de)(de)使用是因為它優(you)先進入胰(yi)(yi)腺腺泡(pao)組織并改變其密度(du)，從(cong)而更有利于(yu)胰(yi)(yi)島分(fen)離。
利用梯度isopyknic iodixanol（異磷碘二醇(chun)）在Cobe 2991細胞分(fen)(fen)離(li)(li)器上分(fen)(fen)離(li)(li)胰(yi)(yi)島，對于組(zu)織體積超(chao)過25 mL，可使(shi)用Cobe袋解離(li)(li)處理。分(fen)(fen)別收集胰(yi)(yi)島純度>80%、50-80%和30-50%的組(zu)分(fen)(fen)進行(xing)洗滌，然后放(fang)入添(tian)加了0.025%的人血清白(bai)蛋白(bai)CMRL 1066的組(zu)織培養(yang)搖瓶中在37°C下(xia)(xia)培養(yang)12-24小(xiao)時(shi)，在22°C下(xia)(xia)再(zai)培養(yang)24-48小(xiao)時(shi)。然后移(yi)植前，清洗胰(yi)(yi)島并懸浮在200 mL室溫移(yi)植培養(yang)基(ji)中輔以肝素添(tian)加，移(yi)植待用。
3、解(jie)離效果
最終(zhong)整個(ge)胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)解離的(de)(de)(de)實(shi)驗發(fa)現(xian)1600U膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶(mei)&200U中性(xing)蛋白(bai)酶(mei)在(zai)總體(ti)積為350毫升的(de)(de)(de)消(xiao)化(hua)體(ti)系中處理100克胰(yi)腺產(chan)生最佳的(de)(de)(de)胰(yi)腺消(xiao)化(hua)效(xiao)果以及最高的(de)(de)(de)胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)產(chan)量(liang)。如文獻表(biao)2種所示，這樣(yang)組(zu)合酶(mei)的(de)(de)(de)使用量(liang)低于(yu)該研(yan)究中其(qi)他膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶(mei)的(de)(de)(de)用量(liang)，而且本(ben)次(ci)(ci)研(yan)究中獲得(de)的(de)(de)(de)組(zu)合酶(mei)的(de)(de)(de)標(biao)準化(hua)濃度(du)從大(da)多數(shu)捐贈者(zhe)的(de)(de)(de)胰(yi)腺組(zu)織解離應用中產(chan)生了(le)相對最好的(de)(de)(de)胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)產(chan)量(liang)。研(yan)究者(zhe)還評(ping)(ping)估了(le)不同批(pi)次(ci)(ci)的(de)(de)(de)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶(mei)酶(mei)，以確定不同批(pi)次(ci)(ci)之間(jian)是(shi)否存在(zai)顯著的(de)(de)(de)差異(yi)性(xing)。14個(ge)臨(lin)床胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)移(yi)植(zhi)手術使用了(le)4個(ge)不同批(pi)次(ci)(ci)的(de)(de)(de)膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶(mei)NB1和4個(ge)不同批(pi)次(ci)(ci)的(de)(de)(de)中性(xing)蛋白(bai)酶(mei)NP1，所有的(de)(de)(de)批(pi)次(ci)(ci)都產(chan)生了(le)相似的(de)(de)(de)消(xiao)化(hua)時(shi)間(jian)、胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)產(chan)量(liang)、活力(li)、培養存活率和移(yi)植(zhi)后(hou)功能。在(zai)實(shi)驗室(shi)有限的(de)(de)(de)小范圍批(pi)次(ci)(ci)系列實(shi)驗表(biao)明，該組(zu)合酶(mei)的(de)(de)(de)批(pi)次(ci)(ci)是(shi)相對一(yi)致的(de)(de)(de)，但(dan)因為膠原(yuan)(yuan)(yuan)酶(mei)批(pi)次(ci)(ci)間(jian)差異(yi)性(xing)仍(reng)然是(shi)胰(yi)島(dao)(dao)(dao)(dao)移(yi)植(zhi)的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)重要關鍵(jian)所在(zai)，需要后(hou)期進行更大(da)規模的(de)(de)(de)研(yan)究來充分評(ping)(ping)估這一(yi)因素。
表2 應用兩種不同胰島(dao)解(jie)離的膠原(yuan)酶(mei)方案的臨床比較
組合(he)酶解離胰(yi)島相對其他單一酶產品(pin)的優勢是因為中性(xing)(xing)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)與(yu)膠原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)比(bi)值對于(yu)成功的(de)(de)(de)胰(yi)島分(fen)離至關重要(yao)，可以靈活(huo)的(de)(de)(de)根據被處理的(de)(de)(de)胰(yi)腺個體特征（如(ru)年齡和器官的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)(yi)性(xing)(xing)等捐(juan)贈者的(de)(de)(de)特征差(cha)異(yi)(yi)）來調整膠原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)和中性(xing)(xing)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)比(bi)例(li)獲得最(zui)佳解離效果，Bucher及其(qi)同(tong)事(shi)提出優化(hua)中性(xing)(xing)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)與(yu)膠原(yuan)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)比(bi)率對于(yu)自體移植胰(yi)島的(de)(de)(de)分(fen)離至關重要(yao)，例(li)如(ru)纖維化(hua)胰(yi)腺可能受益于(yu)更高(gao)比(bi)例(li)的(de)(de)(de)中性(xing)(xing)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)（文(wen)獻(xian)3）。此外組合酶(mei)(mei)(mei)中的(de)(de)(de)這種單(dan)個酶(mei)(mei)(mei)組分(fen)的(de)(de)(de)分(fen)開(kai)存儲也提高(gao)了(le)工作時每種酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)發揮的(de)(de)(de)穩定性(xing)(xing)（文(wen)獻(xian)1）。
圖(tu)3 Nordmark 無(wu)動物源AF-1 GMP級膠(jiao)原(yuan)酶(mei)
胰(yi)島(dao)解離方(fang)案的(de)組合膠原(yuan)酶產品級(ji)別包括科研級(ji)和(he)GMP兩種級(ji)別（圖3和(he)圖4），這兩個級(ji)別具有相似的(de)成(cheng)分和(he)活性，區別是后者(zhe)根據(ju)歐(ou)盟GMP指南生產，并被(bei)制造(zao)商推薦可用(yong)于臨床胰(yi)島(dao)移植。為了(le)(le)符合胰(yi)島(dao)設施的(de)cGMP法規(gui)和(he)CIT的(de)要求(qiu)，本次研究只使用(yong)了(le)(le)GMP級(ji)組合膠原(yuan)酶。
圖4 Nordmark 科研優(you)質級NB1膠(jiao)原酶(mei)
德國 Nordmark 公司全球知名的膠原酶生產商，具備超過30年的高質量膠原酶專業供應，按照制藥級標準進行純化和生產，按照不同種屬、組織/器官、細胞類型進行分類為組織細胞解離的提供整體解決方案（圖5），包括從科研級到無動物源GMP級別多重選擇，且相關GMP產品已在FDA備案DMF。滿足用戶絕大多數組織/器官的單細胞解離需求，包括提供敏感細胞解離專用的溫和解離酶方案；使用簡單，提供優化過的細胞解離Protocol和 各類應用的大量文獻支持。
圖5 Nordmark 膠原(yuan)酶NB系列產品-從科(ke)研到GMP級(ji)的全線組織細胞解離方(fang)案(an)
文中提到的Serva公司是Nordmark 曾在 2002 年合作的營銷供應商，但是自2018 年，Nordmark 為更好地服務于細胞治療與再生醫學領域客戶，改由全球范圍內Nordmark自主營銷 Collagenase NB 產品,且在中國授權上海曼博生物作為其中國合作伙伴，代理和營銷Nordmark全線膠原酶產品（圖6）。
圖6 曼博(bo)生物-Nordmark中國區一級代理商
參考(kao)文獻
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