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背景

肝(gan)(gan)臟(zang)是(shi)最易受藥物毒(du)性(xing)和(he)藥物性(xing)肝(gan)(gan)損(sun)傷（DILI）影響的(de)(de)器官之一。DILI是(shi)藥物消(xiao)耗的(de)(de)主要原(yuan)因(yin)，已知超過750種FDA批(pi)準的(de)(de)藥物具有一定程度的(de)(de)DILI風險[1]。在藥物研發中，有許(xu)多降低DILI風險的(de)(de)策(ce)略，近年來，人們的(de)(de)注意力轉向(xiang)了人體體外3D肝(gan)(gan)臟(zang)模型，以更好地在早(zao)期和(he)臨(lin)床前預(yu)測(ce)DILI[2]。這(zhe)些模型在生理相關的(de)(de)環境中培養原(yuan)代(dai)人肝(gan)(gan)細胞，通常采用共培養的(de)(de)方式，使其能夠長(chang)時間(jian)保持功(gong)能。

此文中，我們(men)評(ping)估(gu)了一種微生理系統（MPS），也稱為器(qi)官芯片（OOC），其體(ti)外肝(gan)臟(zang)模(mo)型(xing)是(shi)否(fou)可(ke)用(yong)于了解(jie)肝(gan)臟(zang)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)詳細機制方面(mian)。MPS先前(qian)已(yi)被證明可(ke)在液(ye)流狀態下維持高度功能(neng)(neng)(neng)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)3D肝(gan)臟(zang)微組織長(chang)達4周[3]，這可(ke)能(neng)(neng)(neng)使(shi)其非(fei)常適合評(ping)估(gu)DILI。我們(men)使(shi)用(yong)了兩(liang)種抗糖尿病的(de)(de)噻(sai)唑烷二酮類(lei)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)，曲格列酮（獲得市(shi)場批準，但(dan)(dan)后(hou)來因DILI而退(tui)市(shi)）和吡格列酮（批準的(de)(de)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)，但(dan)(dan)已(yi)知(zhi)具備DILI風(feng)險）以評(ping)估(gu)MPS是(shi)否(fou)可(ke)檢(jian)測急性(xing)(xing)(xing)(xing)和慢性(xing)(xing)(xing)(xing)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)。這兩(liang)種化(hua)合物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)DILI通(tong)常很難使(shi)用(yong)標(biao)準的(de)(de)體(ti)外肝(gan)臟(zang)分(fen)析實驗和體(ti)內臨床前(qian)模(mo)型(xing)進(jin)行(xing)檢(jian)測[4]。對(dui)于每種化(hua)合物(wu)(wu)(wu)(wu)，進(jin)行(xing)一系列功能(neng)(neng)(neng)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)肝(gan)臟(zang)特異性(xing)(xing)(xing)(xing)終點（包括臨床生物(wu)(wu)(wu)(wu)標(biao)記物(wu)(wu)(wu)(wu)）的(de)(de)濃度反應分(fen)析，以生成EC50曲線。對(dui)功能(neng)(neng)(neng)性(xing)(xing)(xing)(xing)肝(gan)臟(zang)特異性(xing)(xing)(xing)(xing)終點進(jin)行(xing)分(fen)析，以從MPS中創建一個獨特的(de)(de)機理的(de)(de)“肝(gan)毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)特征”，以證明其評(ping)估(gu)新型(xing)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)人類(lei)DILI風(feng)險的(de)(de)能(neng)(neng)(neng)力。

研究目(mu)的

1．展示MPS平臺生(sheng)成(cheng)已知(zhi)毒物曲格列酮六(liu)個毒理學終點 EC50 曲線(xian)的能(neng)力。

2．證(zheng)明(ming)MPS平臺可以檢(jian)測輕度(du)毒物吡(bi)格(ge)列酮的DILI反應(ying)。

3．演示使用(yong)多終(zhong)點分析如(ru)何生成肝毒(du)性特征(zheng)。

材料和方(fang)法

種板：

冷凍保存的原代人肝細胞（PHH）來自BioIVT (歐洲)。實驗開始前一天在PhysioMimix OOC MPS-LC12 板(CN Bio Innovations)中種植0.6 x 10⁶ PHH于種板培養基 (William's E Medium, 3.6% Cocktail A, 5% FBS, 1 μM Dexamethasone)中。Day 1更換維持培養基 (William's E Medium, 4% Cocktail B and 1 μM Dexamethasone)，細胞在PhysioMimix平臺培養2周。

給(gei)藥：

Day4，在含有(you)(you)0.1% DMSO的WEM維(wei)持培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)以7種濃度給(gei)藥(yao)每(mei)種化合物(wu)(wu)，每(mei)48小時給(gei)藥(yao)一次，持續8天(tian)。空(kong)白對(dui)照(zhao)為含有(you)(you)0.1%DMSO的WEM維(wei)持培(pei)養(yang)(yang)基。給(gei)藥(yao)和對(dui)照(zhao)的孔在整個平板上隨(sui)機分配，每(mei)個條件測(ce)試三次。化合物(wu)(wu)采購自(zi)Tocris Bioscience公司(si)。

分析(xi)：

白蛋(dan)白（albumin）的(de)產生通過(guo)ELISA（R&D systems）進(jin)行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)量，LDH的(de)釋放通過(guo)Cyto-tox96分析（Promega）進(jin)行(xing)定(ding)(ding)量，尿素（urea）合(he)成使(shi)用QuantiChrom 試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)定(ding)(ding)量，使(shi)用P450 Glo CYP3A4試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)CYP3A4活(huo)性(xing)（Promega），用丙氨(an)酸(suan)轉氨(an)酶活(huo)性(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)（Abcam）測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)ALT活(huo)性(xing)，用CellTiter- Glo 3D細胞活(huo)力(li)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)（Promega）測(ce)(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)細胞活(huo)力(li)。

結(jie)果

圖 1 – 肝(gan)臟 MPS 模型維持3D人肝(gan)微(wei)組織

A: 體外模型采用PhysioMimix OOC微(wei)生理(li)系統，其(qi)使用開放的孔板(ban)，設計用于在工程(cheng)支架(jia)中對原代(dai)肝細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)3D培養。

B: MPS-LC12肝芯(xin)片(pian)板、支架(jia)及其微(wei)通(tong)道內形(xing)成的肝臟3D微(wei)組(zu)織的示意圖。

C: 3D極(ji)性化肝微(wei)組織形成重建了肝臟(zang)微(wei)結構(gou)的證據。

圖 2 – 肝MPS產生高度(du)一致性和高度(du)功能化(hua)的肝微組織

給藥前，評估肝臟微組織的 A: 尿素合成和B: CYP3A4酶活性。 紅點-使用曲格列酮處理前的組織培養物，藍點-使用吡格列酮處理前的組織培養物。所示數據包括 mean values ± SD (N=24)。尿素QC合格范圍 = 40~100 ug/10⁶ cells/day. CYP3A QC 合規范圍= 1~5 pmol/10⁶ cells/day。

圖 3 – 急性和慢性暴露于曲格列酮后測定多個肝毒性終點指標的EC50濃度

分(fen)析暴(bao)露(lu)于(yu)化合物中的肝臟微組織的 A: LDH釋放；B: ALT釋放；C: Albumin產(chan)生；D: Urea合成(cheng)；E: CYP3A4活性(xing)；F: ATP含量。藍線(xian)-急性(xing)暴(bao)露(lu)（48小(xiao)時），紅線(xian)-慢性(xing)暴(bao)露(lu)（192小(xiao)時）。從(cong)相同的肝臟MPS培養物中測量所有(you)終(zhong)點。所示數(shu)據為 mean± SD，N=3。

圖 4–在微組(zu)織(zhi)接觸曲(qu)格(ge)列酮(tong)和(he)吡格(ge)列酮(tong)后(hou)測量肝臟生(sheng)物標志物隨(sui)時間(jian)的變化顯示(shi)急(ji)性(xing)和(he)慢(man)性(xing)毒性(xing)效應(ying)

肝臟微組(zu)織暴(bao)露于(yu)曲格(ge)列酮(tong)和(he)吡格(ge)列酮(tong)48小(xiao)時(shi)（藍色）、96小(xiao)時(shi)（紅色）、144小(xiao)時(shi)（綠色）和(he)192小(xiao)時(shi)（紫色）。細(xi)胞培養(yang)基每48小(xiao)時(shi)更新一(yi)次，并(bing)分析(xi)白(bai)蛋白(bai)和(he)尿素合成。數(shu)據(ju)顯示為 mean± SD，N=3。

表 1? 肝臟微組織檢測曲格列酮和吡格列酮的毒性

肝(gan)臟微組織暴露于這兩(liang)種化合物48小時(shi)或192小時(shi)。 ND=數據(ju)不可繪制為 EC：50 曲線(xian)。橫線(xian)=未分析。所示數據(ju)來自七個(ge)劑量反應，每濃度N=3。

結論(lun)

采(cai)用肝臟(zang)MPS模型研(yan)究曲格列(lie)酮和(he)吡格列(lie)酮的(de)(de)急性和(he)慢性暴露。細胞功(gong)能和(he)細胞健康終點(dian)被(bei)用來創建一個獨(du)特的(de)(de)機理性“肝毒性特征”圖譜，并(bing)證明MPS預測DILI風險的(de)(de)能力。將ALT（一種常規(gui)測量(liang)的(de)(de)臨床(chuang)標志(zhi)物）納(na)入(ru)終點(dian)小組，可(ke)以在體外數(shu)據和(he)體內(nei)結(jie)果之(zhi)間進(jin)行直接比較。

曲格列酮引起明顯的急性毒性反應，C_max驅動，在15倍C_max附近測到ALT和LDH釋放以及白蛋白和尿素產量的快速降低。細胞終點（CYP活性和ATP含量）進一步證實了曲格列酮的毒性，從所有分析中得出了高度可比的 EC50 值。該數據反映了其他高級3D體外模型的數據，這些模型也報告了曲格列酮相似的 EC₅₀ 值，其表現優于標準體外PHH培養（在這些培養中未無法檢測到這種DILI誘導劑^[4]）。

對吡格列酮的急性和慢性毒性效應都進行了檢測。沒有檢測到LDH或者ALT釋放，然而，在48小時后，檢測到在大約25倍C_max附近，白蛋白和尿素的輕度減少。對白蛋白的影響持續了192小時，而在吡格列酮高濃度（約100倍C_max）下觀察到CYP活性和ATP含量的降低。總之，這些結果證明了肝臟MPS具有檢測輕度DILI問題化合物毒性的能力。這優于未觀察到吡格列酮毒性的其他先進體外肝臟模型^[4]。

這(zhe)(zhe)些(xie)數據證明了(le)測量一系(xi)列終點以(yi)產(chan)生(sheng)“肝毒性特征(zheng)”圖譜的價值，因為(wei)通過(guo)這(zhe)(zhe)樣做(zuo)，可(ke)以(yi)識別(bie)具(ju)有不同(tong)DILI問(wen)題的藥(yao)物(wu)(wu)（包括其他(ta)體外(wai)方法(fa)無法(fa)檢(jian)測到的化合物(wu)(wu)），并揭示這(zhe)(zhe)種(zhong)毒性的機制。通過(guo)將這(zhe)(zhe)種(zhong)肝臟MPS模型納入藥(yao)物(wu)(wu)開發(fa)工作流程，它將使人們更(geng)好(hao)地理解DILI的機制，并通過(guo)在開發(fa)過(guo)程的早期（臨床試驗(yan)開始之前）識別(bie)具(ju)有人類特異性DILI問(wen)題的化合物(wu)(wu)，幫(bang)助減(jian)少藥(yao)物(wu)(wu)消耗。

1.  Thakkar,S. et al. The Liver Toxicity Knowledge Base (LKTB) and drug-induced liver injury (DILI) classification for assessment of human liver injury. Expert Review of Gastroenterology and Hepatology vol. 12 31–38(2018).

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4.  Proctor, W. R. et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Arch. Toxicol. 91, 2849–

關于(yu)CN-Bio PhysioMimix

CN Bio的(de)器官(guan)芯(xin)片系(xi)統，包括PhysioMimix實(shi)驗室臺式儀(yi)器，使(shi)研(yan)究人(ren)(ren)(ren)員能(neng)夠通(tong)過(guo)快速、且具(ju)有預測性(xing)的(de)、基于人(ren)(ren)(ren)體組(zu)織的(de)研(yan)究，在實(shi)驗室中(zhong)對人(ren)(ren)(ren)體生物學(xue)進行建(jian)模。該技術彌補了傳統細胞培養與人(ren)(ren)(ren)體研(yan)究之間的(de)鴻溝，朝著模擬(ni)人(ren)(ren)(ren)體生物學(xue)微環境的(de)方向前進，以支持加速開發(fa)包括腫瘤(liu)學(xue)，傳染病，新陳(chen)代(dai)謝和炎癥(zheng)在內的(de)應用領域的(de)新療法。

CN Bio PhysioMimix 系(xi)列包(bao)括(kuo)T1和M1兩款微(wei)流(liu)控(kong)器官芯片(pian)系(xi)統(tong)，分(fen)別驅動單器官芯片(pian)模型和多器官芯片(pian)模型。每套系(xi)統(tong)標(biao)準(zhun)配置包(bao)括(kuo)：

1）一(yi)臺置于細胞(bao)培養箱外部的控(kong)制器(qi)；

2）一(yi)臺置于二(er)氧化碳培養箱(xiang)中(zhong)的擴展底(di)座；

3）以及對(dui)應的三套微(wei)流控芯片板(ban)驅(qu)動器。

目(mu)前已經開發成熟的應用是在(zai)CN-Bio的單器(qi)官(guan)微(wei)流控(kong)芯(xin)(xin)片板LC12和T12，以及雙(shuang)器(qi)官(guan)微(wei)流控(kong)芯(xin)(xin)片板TL6上實現的。

參考文獻

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