發布時間：2022/07/27 點擊數：707 一、簡介
Akura 96/384孔(kong)微(wei)球(qiu)培(pei)養(yang)板(ban)是一種經過(guo)精心設(she)計和(he)(he)工程改造的(de)超低吸附培(pei)養(yang)板(ban)，可以(yi)用(yong)于無(wu)支架3D細胞模型的(de)構(gou)建和(he)(he)測試(shi)。培(pei)養(yang)板(ban)具有獨特的(de)深孔(kong)構(gou)造，其(qi)特殊的(de)SureXchange換液平臺可以(yi)簡便地實(shi)現更(geng)為溫和(he)(he)和(he)(he)徹底(di)的(de)培(pei)養(yang)基交換。Akura系列(lie)培(pei)養(yang)板(ban)中產生的(de)細胞微(wei)球(qiu)大(da)小均勻，適用(yong)于開(kai)展高通(tong)量(liang)、高重復、高可靠性(xing)的(de)測試(shi)實(shi)驗(yan)，并(bing)能廣(guang)泛兼容多(duo)種終點分析和(he)(he)生化分析以(yi)及大(da)多(duo)數(shu)高分辨(bian)率的(de)細胞成像應用(yong)。
以下實驗(yan)(yan)(yan)方(fang)案(an)描述了使(shi)用(yong)(yong)Akura系(xi)列(lie)培(pei)養(yang)板生成(cheng)3D腫瘤(liu)微球的(de)實驗(yan)(yan)(yan)方(fang)法，旨在為成(cheng)功開展實驗(yan)(yan)(yan)提供詳細(xi)的(de)指導，并(bing)提高首次使(shi)用(yong)(yong)產(chan)品的(de)體驗(yan)(yan)(yan)。本方(fang)案(an)包括(kuo)了培(pei)養(yang)板的(de)準備(bei)、單(dan)細(xi)胞懸液的(de)制備(bei)、細(xi)胞鋪板密(mi)度的(de)優(you)化、細(xi)胞快(kuai)速和均(jun)勻聚集的(de)技巧以及(ji)建議的(de)質(zhi)量控制步(bu)驟。
二(er)、HCT-116和(he)HEY的(de)3D細(xi)胞模(mo)型構建(jian)（Akura 96孔微球培(pei)養板，圖(tu)1）
圖1：Akura 96孔超低吸附微球培養板（InSphero，CS-09-004-03）
1、實驗材料
? 凍存的HCT-116細胞（人結腸癌細胞系：ATCC，CCL-247）和HEY細胞（人卵巢癌細胞系：ATCC，CRL-3252），1 x 106細胞/管
? 適(shi)宜(yi)的細(xi)胞培養基
? T75細胞培(pei)養瓶（Greiner，658175）
? Akura 96孔(kong)微球培(pei)養板（InSphero，CS-09-004-03）
? 無(wu)菌PBS緩沖液（無(wu)鈣(gai)鎂離子(zi)）（Sigma-Aldrich，D1408）
? 胰酶(mei)
? 70%乙醇(chun)
? 血球計數板
? 水浴鍋(guo)（設(she)置在37℃）
? 血清(qing)移液(ye)管（5ml和10ml）
? 離心機
? 一級生物(wu)安全(quan)柜
? 二氧化碳培養箱（設置在5% CO2濃度和37℃）
? 倒置顯微鏡
? 15ml無菌離心(xin)管
? 多通(tong)道移液(ye)器、適(shi)配的無(wu)菌吸頭、無(wu)菌試劑槽
? ; 可選(xuan)項(xiang)：自動(dong)化明場細胞微(wei)球成像儀（SCREEN Cell3iMager）
2、HCT-116和(he)HEY細胞的擴增(zeng)
注意：所有實(shi)驗步驟(zou)遵照無菌操(cao)作規(gui)范在生物安全柜中操(cao)作。
1. 確保所有細胞培養(yang)基標記清(qing)晰并在(zai)正確的條件下(xia)存(cun)放(fang)。
2. 將培養(yang)基(ji)預熱(re)至(zhi)37℃。
3. 向(xiang)T75中加(jia)入5ml預熱的培(pei)養基。
4. 在水浴鍋中(zhong)快速融化細胞。
5. 使(shi)用血清移液管吸取5ml預(yu)熱的培(pei)養基，并(bing)于融化的細胞混合，將(jiang)混勻液轉移至15ml離心管中。
6. 室(shi)溫下(xia)離心，200 RCF 2min，棄去上(shang)清液(ye)，并用5ml預熱培養基重懸細(xi)胞(bao)。
7. 將細胞轉移至T75中(zhong)。
8. 將(jiang)T75轉移至二氧(yang)化碳(tan)培養箱中(zhong)。
9. 培(pei)養(yang)24h后，更換培(pei)養(yang)基，并在顯微鏡下(xia)檢查(cha)細胞貼附情況(kuang)。
10.當細(xi)胞達到70-80%交匯度時（約(yue)48h）可以用于下(xia)游的細(xi)胞微球培養。
3、制備單細(xi)胞懸液(ye)
1. 將培養基預熱(re)至(zhi)37℃。
2. 將T75從二氧化碳培養(yang)箱(xiang)中取出，使(shi)用血清(qing)移(yi)液管棄去培養(yang)基。
3. 向(xiang)T75中加(jia)入(ru)10ml的(de)PBS。
4. 輕輕搖晃培(pei)養瓶后棄去PBS。
5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵(fu)育5min。
6. 加入9ml的(de)完全培養(yang)基（含FBS）終(zhong)止消化。
7. 將(jiang)細胞液轉移至(zhi)15ml離心管。
8. 室溫下離(li)心，200 RCF 2min，棄(qi)去上清液，并用(yong)適量（取決于細胞壓(ya)積）預熱培養基重懸細胞。
9. 使用(yong)血球計數器（或其他細胞技術方法）進行計數。
10.調整細胞密度至1.43 x 105細胞/ml（即10000細胞/70μl）及其他濃度（即2500細胞/70μl，500細胞/70μl，100細胞/70μl）。
4、3D細胞模型的構(gou)建(jian)-鋪(pu)板（圖2）
圖2：Akura 96孔(kong)微(wei)球培養板的使用流程
1. 使用70%乙醇擦拭Akura培(pei)養(yang)板的外包裝，并在生物(wu)安全柜中取出Akura培(pei)養(yang)板。
2. 將單(dan)細(xi)胞(bao)懸液轉移至試(shi)劑(ji)槽中，使(shi)用移液器輕(qing)輕(qing)吹(chui)打細(xi)胞(bao)懸液以保證(zheng)濃度均一。
3. 使用(yong)多通道(dao)移液器或自(zi)動化工(gong)作站將細胞種植至Akura培(pei)養板，每孔70μl。
4. 蓋上板(ban)蓋，室(shi)溫下離(li)心，250 RCF 2min。
5. 將培養板轉(zhuan)移至濕潤的二氧化碳培養箱中(zhong)，并保持斜立（與(yu)水平面夾角(jiao)30度(du)，圖(tu)3）。此過(guo)程可以(yi)使(shi)用InSphero專門設計的Akura斜立支架（InSphero，CS-10-002-00）或將培養板的一側(ce)墊高。
圖3：Akura斜(xie)立支架（InSphero，CS-10-002-00）
6. 3D細胞(bao)模型的(de)大小和活力檢測(ce)可(ke)以使用明(ming)場成像系統（如SCREEN Cell3iMager）以及活力檢測(ce)試劑(ji)盒（Promega Celltiter-Glo Assay）。
5、結(jie)果(guo)
圖片展示了成熟(shu)3D細(xi)胞(bao)模(mo)型(xing)的(de)代表(biao)性結果，包括(kuo)取決于鋪板(ban)密度的(de)細(xi)胞(bao)微球(qiu)尺寸和(he)兩種細(xi)胞(bao)的(de)模(mo)型(xing)比較（圖4-5），以及(ji)培養板(ban)孔間細(xi)胞(bao)微球(qiu)尺寸的(de)均一性（圖6）。
圖4：不同細胞類型使用不同數量細胞進行鋪板并培養3天時細胞微球(qiu)的明場成像
圖5：不同細胞類型(xing)使用(yong)不同數量細胞進(jin)行鋪板并培(pei)養3天時細胞微球直徑分布（6個重復(fu)）
圖6：HCT-116細(xi)胞(bao)培養(yang)3天后腫(zhong)瘤微球(qiu)的直徑(jing)均(jun)一性，A為明場(chang)圖片，B為直徑(jing)分布熱圖
6、結論
Akura 96孔(kong)微球(qiu)(qiu)培(pei)(pei)養(yang)(yang)板是為3D細(xi)胞模型的(de)常規生成和長(chang)期培(pei)(pei)養(yang)(yang)而設計的(de)。惰性(xing)超低(di)吸附(fu)表面(mian)確(que)保(bao)細(xi)胞微球(qiu)(qiu)在(zai)生長(chang)過程中不(bu)會粘附(fu)在(zai)板內。獨特的(de)SureXchange換液平臺可(ke)(ke)實現(xian)大于90%的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基更換，同時保(bao)護細(xi)胞微球(qiu)(qiu)避免其被意(yi)外(wai)吸去(qu)或損壞。培(pei)(pei)養(yang)(yang)板的(de)環烯(xi)烴聚合物（COP）材質可(ke)(ke)以(yi)(yi)與大多數溶劑(ji)兼(jian)(jian)容，因此(ci)可(ke)(ke)以(yi)(yi)在(zai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)板中直接(jie)進行多種終點(dian)分(fen)析和生化分(fen)析。培(pei)(pei)養(yang)(yang)板的(de)尺寸(cun)符合ANSI/SLA標準(zhun)，確(que)保(bao)了其可(ke)(ke)以(yi)(yi)很好地兼(jian)(jian)容自(zi)動化系統和常規實驗環節(jie)。平坦(tan)透明的(de)底部可(ke)(ke)在(zai)各種顯微鏡和高內涵成像(xiang)平臺上實現(xian)真實、非(fei)扭曲的(de)亮(liang)場(chang)和熒光(guang)成像(xiang)。
三、NCI-N87-GFP和NIH-3T3-RFP共培養的3D細胞模型構建（Akura384孔微球培養板，圖7）
圖7：Akura 384孔(kong)超低吸附微球培養板（InSphero，CS-09-003-02）
1、實(shi)驗(yan)材(cai)料
? Akura 384孔微(wei)球(qiu)培養(yang)板(ban)（InSphero，CS-09-003-02）
? 熒光顯微鏡或高內涵(han)細胞成像儀（Leica DMi8或Yokogawa CQ1）
? 其他項(xiang)目(mu)參見(jian)“第二部(bu)分-實(shi)驗材料”
2、NCI-N87-GFP和(he)NIH-3T3-RFP細胞(bao)的擴增
實(shi)驗(yan)步驟同上(shang)，參照“第二部分(fen)- HCT-116和HEY細胞的擴增”。
3、培養板的(de)準備-預濕潤
注(zhu)意(yi)事項：
? 在使用(yong)前對Akura 384孔(kong)微球培(pei)養板進行(xing)預濕潤操(cao)作，可(ke)以有(you)效避免孔(kong)內(nei)氣(qi)泡的產生(sheng)
? Akura 384孔微球培養板(ban)的底(di)部是25μm厚的氣(qi)透膜，在實驗操作時請注意(yi)移(yi)液器(qi)吸頭不要接(jie)觸底(di)部的氣(qi)透膜以免造成損壞(huai)
? Akura 384孔微球培養板的(de)(de)孔內結構(gou)是非軸對稱的(de)(de)，其(qi)換(huan)液平臺在靠(kao)近孔上側的(de)(de)位置（A行(xing)(xing)），其(qi)容納細胞的(de)(de)深孔在靠(kao)近孔下側的(de)(de)位置（P行(xing)(xing)）（圖8）
圖8：Akura 384孔微球培(pei)養(yang)板孔內設計
? 所有實驗步驟遵(zun)照(zhao)無菌操(cao)作規范在生物安全(quan)柜中(zhong)操(cao)作
1. 向每孔加(jia)入50μl PBS溶(rong)液。請讓吸頭尖端盡量靠近但是不要觸碰孔底。此過程(cheng)建(jian)議(yi)使用(yong)多通(tong)道移液器完成(cheng)。
2. 室溫(wen)下離心，250 RCF 2min。
3. 將(jiang)培(pei)養板轉移至濕潤的二氧化碳培(pei)養箱，并孵(fu)育1天以上(shang)。
4. 在開展培養(yang)實驗前，將培養(yang)板從(cong)二(er)氧(yang)化碳(tan)培養(yang)箱(xiang)中取出。
5. 室(shi)溫下離心，250 RCF 2min，并棄去(qu)PBS。
4、制備單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)
1. 除額外說明(ming)的步(bu)驟，其余步(bu)驟與(yu)“第(di)二部(bu)分-制備(bei)單細胞懸液”相(xiang)同。
2. 細胞密(mi)度(du)調整(zheng)：調整(zheng)細胞密(mi)度(du)至(zhi)500細胞/50μl至(zhi)3000細胞/50μl（依據(ju)鋪板密(mi)度(du)）。
5、3D細胞模(mo)型的構建-鋪(pu)板（圖9）
圖9：Akura 384孔微球培養板的使用(yong)流程
1. 除額外說明的步驟，其余步驟與“第二(er)部分-制備單細胞懸液(ye)”相同(tong)。
2. 使用(yong)多通道移(yi)液器或自動(dong)化工作站(zhan)將細胞種植(zhi)至Akura培(pei)養板(ban)，每孔50μl。
3. 3D細胞(bao)模型的大小和(he)活力(li)檢測(ce)可以使用明場成像系統（如SCREEN Cell3iMager）、熒光顯微鏡（Leica DMi8或Yokogawa CQ1）以及活力(li)檢測(ce)試劑(ji)盒（Promega Celltiter-Glo Assay）。
6、結果
腫瘤細(xi)胞和成纖維細(xi)胞可以在Akura 384孔微球培養板中通(tong)過(guo)無(wu)支架、重(zhong)力輔(fu)助的方法生成尺寸均勻的致(zhi)密細(xi)胞微球（圖10），是高(gao)(gao)通(tong)量(liang)篩(shai)選的先決條件，并可以很好(hao)地兼容自(zi)動化液體(ti)工作站以及自(zi)動化高(gao)(gao)內涵細(xi)胞成像(xiang)系統，因(yin)此符合(he)基于成像(xiang)的篩(shai)查實驗的需(xu)求。
圖10：NCI-N87-GFP和NIH-3T3-RFP細胞共培養時細胞微球的熒光成像
7、結論
Akura 384孔(kong)微(wei)(wei)球培(pei)(pei)養(yang)板(ban)是為3D細胞模型(xing)的(de)常(chang)(chang)規生(sheng)成和(he)長期培(pei)(pei)養(yang)而設計(ji)的(de)。惰性超(chao)低(di)吸附(fu)表面確(que)保(bao)細胞微(wei)(wei)球在(zai)生(sheng)長過程中(zhong)不會(hui)粘附(fu)在(zai)板(ban)內。獨特的(de)SureXchange換(huan)液平(ping)(ping)臺可(ke)實(shi)現大于(yu)90%的(de)培(pei)(pei)養(yang)基更換(huan)，同時保(bao)護細胞微(wei)(wei)球避(bi)免其被(bei)意外吸去或損(sun)壞(huai)。培(pei)(pei)養(yang)板(ban)的(de)材質可(ke)以與大多數溶(rong)劑兼(jian)(jian)容(rong)，因此可(ke)以在(zai)培(pei)(pei)養(yang)板(ban)中(zhong)直接進行多種終點分(fen)析和(he)生(sheng)化分(fen)析。培(pei)(pei)養(yang)板(ban)的(de)尺(chi)寸符合ANSI/SLA標準，確(que)保(bao)了其可(ke)以很好地兼(jian)(jian)容(rong)自(zi)動化系統和(he)常(chang)(chang)規實(shi)驗環(huan)節。平(ping)(ping)坦透明的(de)底部可(ke)在(zai)各種顯(xian)微(wei)(wei)鏡(jing)和(he)高內涵成像(xiang)平(ping)(ping)臺上實(shi)現真(zhen)實(shi)、非(fei)扭(niu)曲(qu)的(de)亮(liang)場(chang)和(he)熒光(guang)成像(xiang)。
