具有可調節支架材料的(de)無涂層細(xi)胞培養屏障(zhang)芯片

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AKITA的(de)(de)多(duo)功能細胞培養(yang)板，旨在開發用(yong)于臨(lin)床前研究的(de)(de)體(ti)外屏障模(mo)(mo)型，適用(yong)于低通(tong)(tong)量和高通(tong)(tong)量實驗。生(sheng)物屏障建立在半透膜(mo)上，膜(mo)材(cai)料可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)需要進(jin)行定制。通(tong)(tong)過腸道芯片模(mo)(mo)型，我們測(ce)試(shi)了(le)兩種新的(de)(de)生(sheng)物相(xiang)容性支(zhi)架材(cai)料，稱(cheng)為Bio-Spun。這些(xie)(xie)3D電紡納米纖(xian)維膜(mo)——無論是(shi)可(ke)生(sheng)物降解(jie)的(de)(de)（PDLGA-PLLA雙(shuang)層(ceng)）還是(shi)不可(ke)降解(jie)的(de)(de)（聚氨酯或PU）格式——顯示出(chu)與黃金(jin)標準(zhun)二維PET多(duo)孔膜(mo)相(xiang)似或更(geng)優(you)的(de)(de)性能。此外，這些(xie)(xie)Bio-Spun支(zhi)架不需要任(ren)何預(yu)涂層(ceng)，這提高了(le)使(shi)用(yong)的(de)(de)便利性，節省了(le)時間，并(bing)避免(mian)了(le)涂層(ceng)引起的(de)(de)變異性。

引言

傳統的(de)(de)體(ti)外方法在(zai)(zai)早期研究中(zhong)提供的(de)(de)結果在(zai)(zai)評(ping)估人(ren)類藥物或(huo)治療時可靠性較(jiao)低。這些方法使(shi)用(yong)在(zai)(zai)塑料或(huo)玻璃(li)基質上的(de)(de)傳統二維(wei)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)，只能部(bu)分再(zai)現復雜(za)的(de)(de)細(xi)胞(bao)外基質和施加于組織上的(de)(de)機械(xie)力(li)（Yuste等(deng)[1] ，2021）。細(xi)胞(bao)需要非(fei)常特定的(de)(de)培(pei)養(yang)條件和刺激才能如同(tong)在(zai)(zai)體(ti)內一樣發揮(hui)功能。

AKITA Plate旨在(zai)重(zhong)現組(zu)織(zhi)和(he)(he)(he)生物(wu)(wu)界面的(de)(de)微生理條件(jian)。微流控技術的(de)(de)使(shi)用(yong)(yong)使(shi)得雙向流動成為可能(neng)，從而增強了(le)生物(wu)(wu)屏(ping)障(zhang)的(de)(de)完整性和(he)(he)(he)組(zu)織(zhi)的(de)(de)成熟度。AKITA Plate無需(xu)管(guan)道，且兼容(rong)(rong)標準細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養格(ge)式(shi)，可用(yong)(yong)于手動或自動設置(zhi)，從低通量(liang)到高通量(liang)。AKITA Plate還設計用(yong)(yong)于與多種(zhong)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養基質(zhi)結合使(shi)用(yong)(yong)。結合AKITA Plate的(de)(de)新(xin)型細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養支架和(he)(he)(he)聚合物(wu)(wu)的(de)(de)最近開(kai)發，為生成更(geng)(geng)(geng)符(fu)合體(ti)(ti)內(nei)細(xi)胞(bao)應力和(he)(he)(he)應變的(de)(de)三維(wei)體(ti)(ti)外(wai)模型開(kai)辟了(le)新(xin)途徑。這包括(kuo)常用(yong)(yong)的(de)(de)不(bu)同孔徑和(he)(he)(he)涂(tu)層的(de)(de)二(er)維(wei)PET膜(mo)，以及提供更(geng)(geng)(geng)好和(he)(he)(he)更(geng)(geng)(geng)現實(shi)模型的(de)(de)可生物(wu)(wu)降(jiang)解(jie)和(he)(he)(he)生物(wu)(wu)相容(rong)(rong)的(de)(de)三維(wei)支架。

BioSurfaces, LLC（BioSurfaces）開發(fa)了一種(zhong)名為(wei)Bio-Spun的創新三維支架，該支架由無動(dong)物(wu)成分的納米纖維生物(wu)相容材料制成，可(ke)選擇(ze)為(wei)可(ke)降解或不可(ke)降解。Bio-Spun支架用(yong)于創建多種(zhong)細胞系(xi)的三維組織模(mo)型，被(bei)認為(wei)是一種(zhong)更具(ju)成本效益、可(ke)重(zhong)復且可(ke)靠的三維組織培(pei)養方(fang)法。

通過將AKITA Plate的(de)微(wei)流控特性與BioSurfaces的(de)不可(ke)降解(jie)PU和(he)可(ke)降解(jie)PDLGA-PLLA Bio-Spun膜結(jie)合，研(yan)(yan)究(jiu)人員可(ke)以獲得一個可(ke)控且可(ke)定制(zhi)的(de)環境，用于研(yan)(yan)究(jiu)生(sheng)物(wu)屏障。這(zhe)(zhe)種結(jie)合可(ke)能(neng)提供更(geng)(geng)高可(ke)重復(fu)性和(he)更(geng)(geng)可(ke)靠預測體(ti)內細胞對潛在藥物(wu)療(liao)法甚至化妝(zhuang)品成(cheng)分反(fan)應(ying)的(de)體(ti)外結(jie)果。這(zhe)(zhe)最終可(ke)能(neng)會(hui)推動(dong)新療(liao)法和(he)改進療(liao)法的(de)更(geng)(geng)快和(he)更(geng)(geng)具成(cheng)本(ben)效益的(de)發(fa)展，與傳統(tong)動(dong)物(wu)試驗相比，在人體(ti)臨床試驗中失敗的(de)概率更(geng)(geng)低。

材料與方法

AKITA Plate準備：

96孔格式的(de)AKITA Plate包含24個獨立(li)測試單元，可以(yi)在(zai)微通道內進行動(dong)態(tai)流動(dong)培養(yang)，或在(zai)開頂室內進行靜(jing)態(tai)培養(yang)。AKITA Plate的(de)半透膜(mo)（圖1）由BioSurfaces制造，采用可生物降解的(de)納(na)米(mi)(mi)(mi)纖維Bio-Spun PDLGA-PLLA雙層膜(mo)（厚度12微米(mi)(mi)(mi)）或不可降解的(de)納(na)米(mi)(mi)(mi)纖維PU支架（厚度10微米(mi)(mi)(mi)），并與商用的(de)細(xi)胞培養(yang)級二維PET膜(mo)（It4ip，具有3微米(mi)(mi)(mi)蝕刻孔，厚度10微米(mi)(mi)(mi)）進行比(bi)較。

圖1：AKITA微流控板設(she)計

AKITA Plate開發為標準(zhun)的(de)96孔(kong)和384孔(kong)板格式。它們允(yun)許高通量處(chu)理(li)，并提供(gong)易于操作(zuo)的(de)系統。通過AKITA WAVE搖動系統實現的(de)控(kong)制流動，增強了器官芯片模型的(de)成熟度(du)、緊密性和生物相關性。

細胞培養、涂層、細胞種植、屏(ping)障滲透實驗、共(gong)聚焦成(cheng)像方法(fa)略，如需要(yao)請聯系(xi)曼博生物獲取。

結果

01   Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架的Keyence圖像

使用AKITA 96孔板監(jian)測Caco-2細胞在PET膜（對照(zhao)）與BioSurfaces制造的(de)PU和PDLGA-PLLA支架(jia)(jia)上的(de)增殖(zhi)和屏障形成情況。Bio-Spun PU支架(jia)(jia)通過一種(zhong)專(zhuan)有(you)工藝制造，該(gai)(gai)工藝涉及靜電紡絲(si)(si)基于聚(ju)碳酸酯的(de)聚(ju)氨酯。每個孔中(zhong)Bio-Spun PU的(de)表(biao)面拓(tuo)撲(pu)在Keyence激(ji)光顯(xian)微(wei)鏡圖(tu)像中(zhong)顯(xian)示(shi)（圖(tu)2）。彩色(se)箭頭表(biao)示(shi)選定用于纖(xian)維(wei)測量的(de)不同區域。該(gai)(gai)支架(jia)(jia)的(de)平均纖(xian)維(wei)直徑為496納(na)米(mi)（±81納(na)米(mi)）。Bio-Spun PDLGA-PLLA是(shi)一種(zhong)可生物降(jiang)解的(de)雙(shuang)層支架(jia)(jia)，頂側(ce)(ce)含有(you)PDGLA，基底側(ce)(ce)含有(you)PLLA。該(gai)(gai)支架(jia)(jia)在靜電紡絲(si)(si)后(hou)進行后(hou)處理，以(yi)在頂側(ce)(ce)提供熔合拓(tuo)撲(pu)結構。PLLA基底側(ce)(ce)的(de)纖(xian)維(wei)直徑為588納(na)米(mi)（±94納(na)米(mi)）。

圖(tu)2.對照(zhao)PET膜(mo)的表面拓撲為(wei)(wei)具(ju)有(you)(you)3微(wei)米孔的薄膜(mo)。相比之下，Bio-Spun PU支架兩側(ce)的拓撲結構(gou)相似(si)，平均(jun)纖(xian)維直徑為(wei)(wei)496納米。Bio-Spun PDLGA-PLLA雙層支架具(ju)有(you)(you)兩種不同的拓撲結構(gou)，支架在后處理中熔合了PDGLA頂側(ce)的纖(xian)維。PLLA側(ce)的表面形態與PU支架相似(si)（圖(tu)像放(fang)大150倍）。

02   第14天Caco-2上皮的共聚焦顯微鏡圖像

通(tong)過(guo)Calcein染色(se)(se)的(de)(de)活體成像（數據未顯示）監測了Caco-2細(xi)胞(bao)(bao)在整個實(shi)驗中(zhong)的(de)(de)增殖情況。第14天，通(tong)過(guo)共聚焦顯微鏡直接在Akita Plate中(zhong)觀察上(shang)皮細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)匯(hui)合(he)(he)度和厚度（圖(tu)(tu)3）。用鬼筆環肽進(jin)行的(de)(de)肌(ji)動蛋(dan)白(bai)染色(se)(se)顯示，大多數條件下(xia)Caco-2培養(yang)物是(shi)匯(hui)合(he)(he)的(de)(de)。有(you)趣的(de)(de)是(shi)，所有(you)纖維連接蛋(dan)白(bai)涂層(ceng)(ceng)的(de)(de)支架顯示出較厚的(de)(de)Caco-2上(shang)皮，類似于未涂層(ceng)(ceng)的(de)(de)PDLGA-PLLA支架（圖(tu)(tu)3）。這(zhe)(zhe)表明這(zhe)(zhe)些條件更適合(he)(he)Caco-2細(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)。相(xiang)比之下(xia)，未涂層(ceng)(ceng)和涂有(you)膠原蛋(dan)白(bai)的(de)(de)PET膜由于細(xi)胞(bao)(bao)附(fu)著(zhu)性差(cha)和上(shang)皮脫(tuo)落(luo)而未在圖(tu)(tu)3中(zhong)顯示。

圖3.第14天細(xi)胞(bao)的共聚焦成(cheng)像，細(xi)胞(bao)染色(se)為肌動(dong)蛋白（紅色(se)，鬼筆環肽）和細(xi)胞(bao)核（藍色(se)，DAPI）。多(duo)種支架(jia)(jia)（Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架(jia)(jia)，對照PET）涂(tu)有纖(xian)維連接蛋白（Fib）、膠原(yuan)I型（Col-1）或未涂(tu)層。由于(yu)細(xi)胞(bao)附(fu)著(zhu)性差，涂(tu)有膠原(yuan)I型或未涂(tu)層的對照PET膜未顯示。共聚焦成(cheng)像直接在固定于(yu)AKITA板中(zhong)的細(xi)胞(bao)上進行。比(bi)例尺為100微米(mi)，PET膜為70微米(mi)。

03   在不同材料上形成的Caco-2屏障的通透性測定

能(neng)夠注意到，從第7天起，所有(you)支(zhi)架和(he)(he)PET膜(mo)以及各(ge)種(zhong)涂(tu)層(ceng)(ceng)都形成了(le)緊密的(de)10E-6 cm/s屏障，僅有(you)的(de)例外是纖維(wei)連(lian)接蛋白涂(tu)層(ceng)(ceng)或未涂(tu)層(ceng)(ceng)的(de)PET對照膜(mo)（圖4）。可以觀察(cha)到，Bio-Spun PU和(he)(he)PDLGA-PLLA支(zhi)架在未涂(tu)層(ceng)(ceng)的(de)情況(kuang)下表現出相似(si)的(de)通透性(xing)性(xing)能(neng)（圖4）。這為無(wu)涂(tu)層(ceng)(ceng)細胞培養開辟了(le)新(xin)的(de)途徑，結合(he)了(le)使用(yong)方(fang)便(bian)、節(jie)省時間和(he)(he)避免(mian)涂(tu)層(ceng)(ceng)引起的(de)變異性(xing)。

圖4.通透性測定使用0.4 kDa的熒光(guang)素(su)鈉鹽(yan)進(jin)(jin)行。由(you)于疏水性，未涂層的PET對照值未顯示。虛線表示平均空白（無細胞）通透性。實驗以三次重復(fu)進(jin)(jin)行。

04   無細胞通透性

無(wu)論(lun)涂層(ceng)如(ru)何，所有支架和PET膜(mo)在無(wu)細(xi)胞的情況下顯示出相(xiang)似的通(tong)透性值(zhi)（圖(tu)5）。這確(que)認(ren)了(le)Caco-2的高緊密(mi)性是由(you)上皮細(xi)胞引起的，而不是由(you)不同的膜(mo)/支架物理性質造成的。

圖(tu)5.通透(tou)性測(ce)定使用0.4 kDa的熒光素(su)鈉鹽進(jin)行(xing)。實驗以(yi)三次重復進(jin)行(xing)。注意，不(bu)同涂層和膜/支(zhi)架材料(liao)的通透(tou)性評分沒有明顯(xian)差異。

結論

在(zai)AKITA板上的(de)(de)Caco-2腸道(dao)屏障(zhang)模型在(zai)短(duan)時間內通過多種支架類型顯示(shi)了(le)(le)緊密(mi)的(de)(de)屏障(zhang)建立。與(yu)PET膜相比，我們證明了(le)(le)Bio-Spun PU和PDLGA-PLLA支架在(zai)形成緊密(mi)的(de)(de)Caco-2上皮屏障(zhang)時不需要任何涂層。這為(wei)無涂層屏障(zhang)的(de)(de)生成開辟(pi)了(le)(le)新的(de)(de)可能性(xing)，增強了(le)(le)使用(yong)的(de)(de)便利性(xing)，節省了(le)(le)時間，并(bing)避免了(le)(le)涂層引起(qi)的(de)(de)變異(yi)性(xing)和成本。

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