從人類誘導多能干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)分化(hua)出(chu)神(shen)經(jing)元、星形(xing)膠(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)、少突膠(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和小膠(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)以形(xing)成神(shen)經(jing)組織芯片：一種用于評估來自間充質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)外囊泡治(zhi)療潛(qian)力的神(shen)經(jing)炎癥模型

簡介

干細胞(bao)技術的(de)進(jin)步使得生(sheng)(sheng)成具有組織學、分(fen)子和生(sheng)(sheng)理特性的(de)人類化三(san)維 (3D) 模型成為可(ke)能，以及生(sheng)(sheng)產細胞(bao)衍生(sheng)(sheng)的(de)治療(liao)物，如細胞(bao)外囊泡(pao) (EVs)。

在器官芯片平臺和人類誘導多能干(gan)細(xi)(xi)胞(bao) (hiPSCs) 衍生的(de)神(shen)(shen)經(jing)/膠質細(xi)(xi)胞(bao)方面的(de)改進，用(yong)于研究易于設置且快速輸出(chu)的(de)3D個性化神(shen)(shen)經(jing)組織建模。

本文重點介紹了從單一來源hiPSCs分化出神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞的重要步驟。

此外(wai)，我們提出了(le)一(yi)個(ge)定義(yi)明確的(de)人(ren)類化(hua)神經組(zu)織(zhi)芯片(pian)模(mo)型（如上圖），該模(mo)型由具有相同基因背景的(de)分化(hua)細(xi)胞(bao)組(zu)成，并展(zhan)示(shi)了(le)骨髓間(jian)充質干細(xi)胞(bao) (BMSCs) 衍生的(de)細(xi)胞(bao)外(wai)囊泡(pao)（EVs）的(de)治療(liao)潛(qian)力，以提出一(yi)種(zhong)治療(liao)神經炎癥相關(guan)疾(ji)病的(de)新方法。

大約100nm的CD9+EVs在腫瘤壞(huai)死因子-α (TNF-α) 誘導的神經炎癥模型中，促(cu)進了(le)更多的抗炎和細胞(bao)-細胞(bao)相互作用(yong)細胞(bao)因子的反應，有助于重新建模，這是模擬真實神經-膠質病理生理學的理想選(xuan)擇。

本文我(wo)們將重點討論神(shen)經芯(xin)片的(de)構建(jian)過程，而單一來源hiPSCs分化出神(shen)經元、星形膠(jiao)質細胞、少突膠(jiao)質細胞和小膠(jiao)質細胞的(de)關鍵步驟則(ze)略，有(you)需(xu)求的(de)讀者可(ke)聯系曼博生物(wu)獲取(qu)原資源。

神經芯片構建過程

用(yong)于血腦屏障支持(chi)的3D神(shen)經組織的微(wei)流控(kong)芯片平臺是芬(fen)蘭的AKITA，ByFinnadvance。每塊耗材板至多可培(pei)養(yang) 32 個(ge)獨立單(dan)元(yuan)樣品。每個(ge)培(pei)養(yang)單(dan)元(yuan)包括(kuo)一(yi)個(ge)微(wei)通道（位(wei)置 “2”）和一(yi)個(ge)位(wei)于兩個(ge)培(pei)養(yang)基儲存器(qi)（進出口，位(wei)置“1”）之間的培(pei)養(yang)室。

每個培(pei)(pei)養室(shi)通(tong)過一(yi)個薄(bo)膜水平分(fen)為兩(liang)部分(fen)，用(yong)于(yu)內皮(pi)屏障，將下部培(pei)(pei)養室(shi)和開(kai)放式(shi)頂(ding)部培(pei)(pei)養室(shi)（位(wei)置 “3”）分(fen)開(kai)，用(yong)于(yu)3D組織培(pei)(pei)養構建（見圖 1）。

圖1：神經芯片的(de)示(shi)意圖

模擬腦內皮屏障的人腦微血管內皮細胞（hCMEC/D3）從下圖位置“1”中開始種植，并經過培養在位置“2”貼壁。收集人類誘導多能干細胞預分化的四種主要細胞類型：成熟神經元（Mature neurons）、小膠質細胞（Microglia）、星形膠質細胞（Astrocytes）和處于可增殖階段的少突膠質細胞（Oligodendrocytes），并以隨機方式（按文獻指定比例混合細胞類型）與Matrigel基質混合后種植在位置“3”從而形成3D神經組織。（詳細方案可聯系曼博生物獲取原資源）

結果

1   ELISA結果顯示神經芯片能正確反映促炎因子和外泌體EV處理后的抗神經炎癥效果

如圖2所示，促(cu)炎(yan)因(yin)子(zi)、IL-6(從65.5~116.5ng/L)和IL-1β(從15.3~21.5pg/mL)水平升高(p<0.01和p<0.001)與TNF-α水平的可升高至(p<0.0001；TNF-α誘導的神(shen)經炎(yan)癥組在(zai)第2天(tian)結(jie)束時從61.6降至1722pg/mL)，而抗炎(yan)細(xi)胞因(yin)子(zi)IL-10水平(p<0.05，從232降至176ng/mL)與對照組相比下降，驗證了神(shen)經炎(yan)癥在(zai)神(shen)經組織芯片平臺上(shang)的成功再現(xian)。

圖2：神經芯片上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10細胞因(yin)子的ELISA結果(guo)

之后，給其中一個TNF-α組(zu)注射ev。第5d時，TNF-α組(zu)TNF-α(從(cong)(cong)75.7~546.6pg/mL)、IL-6(從(cong)(cong)109.4~192.3 ng/L)和(he)IL-1β(從(cong)(cong)15.7~17.8pg/mL)水平高于對照組(zu)(p<0.01、p<0.001和(he)p<0.05)，3種細(xi)胞因子水平低于對照組(zu)(p<0.05~285.1pg/mL)。p<0.001~118.7ng/L，p< 0.05~16.5pg/mL)，與(yu)TNF-α組(zu)相比(bi)，EV組(zu)與(yu)對照組(zu)基(ji)本(ben)持平。

此外，TNF-α組IL-10水平下降(從254.8降至212.7ng/mL)，由于抗炎反(fan)應，EV給藥后IL-10水平升高(p<0.01至287.6ng/mL)。

2   免疫熒光共聚焦顯微鏡圖像顯示神經芯片能正確反映促炎因子和外泌體EV處理后的抗神經炎癥效果

如(ru)圖3所示，接下(xia)來，檢查(cha)神(shen)經芯片平(ping)臺的主要“神(shen)經組織結構”，嵌(qian)入(ru)在3D水(shui)凝(ning)膠(jiao)中(zhong)，其(qi)中(zhong)CD11b +小膠(jiao)質細胞，TUJ1 +神(shen)經元(yuan)細胞和GFAP +大膠(jiao)質細胞(星形膠(jiao)質細胞和少(shao)突膠(jiao)質細胞)在對(dui)照(zhao)組所描述(shu)的生理條件下(xia)相(xiang)互(hu)通信。

在(zai)TNF-α治(zhi)療(liao)的(de)(de)第2天沒有觀察(cha)到相當大的(de)(de)致死效應，僅在(zai)組織(zhi)和血腦(nao)屏障結構中引(yin)發(fa)炎癥反應。TNF-α處理5天后，除了(le)M1極化(hua)CD11b +小膠質細胞(bao)(bao)表現出促炎反應的(de)(de)數量(liang)較大程度增加外，在(zai)培養過程中，由于炎癥反應的(de)(de)神(shen)經(jing)毒性(xing)作用，神(shen)經(jing)元和大膠質細胞(bao)(bao)失去了(le)活力和通訊能力。

隨(sui)后，給(gei)藥EV增強CD11b +小膠(jiao)質細(xi)胞(bao)的M2極(ji)化，顯示出抗炎反應，并在共培養中保(bao)持TUJ +和GFAP +細(xi)胞(bao)通信和組織完整(zheng)性。

圖3：3D神經組織芯片結(jie)構(gou)的(de)CD11b和TUJI/GFAP標記的(de)免(mian)疫熒光共(gong)聚焦顯微鏡圖像(xiang)（ZeissLSM 880，比例尺100 um）

進(jin)一步表征(zheng)神經(jing)組織芯片模型中的內(nei)皮(pi)，以確定(ding)暴露于TNF-α是(shi)否會導致較大變化(圖4)。對(dui)照組多數ZO-1+和(he)CD-31+細胞在芯片上形成強大的內(nei)皮(pi)屏障。

TNF-α處理導(dao)致CD-31+細胞數(shu)量減少(shao)，這是由于炎癥反應(ying)依賴的(de)細胞毒性，內(nei)皮(pi)細胞屏障(zhang)的(de)破壞，最終(zhong)導(dao)致存活(huo)細胞中ZO-1表(biao)達減少(shao)，而(er)存活(huo)細胞中β-catenin表(biao)達沒有明顯(xian)變化。

然而，TNF-α組(zu)給予ev可促進CD-31+細胞(bao)的存活，抑制(zhi)ZO-1+內(nei)皮屏障(zhang)的破壞，并增加E-cadherin+細胞(bao)群，并具有抗炎反應。

圖(tu)4：BBB屏障的(de)(de)CD-31/E-鈣黏蛋白(bai)和(he)ZO-1/β-連(lian)環蛋白(bai)標(biao)記，在處理5天后(hou)的(de)(de)亮(liang)場圖(tu)像（MoticAE31E，比例尺100 um）和(he)z-stack（合并(bing)所有通道(dao)的(de)(de)正交保護(hu)后(hou)的(de)(de)所有通道(dao)的(de)(de)亮(liang)場圖(tu)像）

3   qRT-PCR分析定量反映神經芯片正確反映促炎因子和外泌體EV處理后的抗神經炎癥效果

除(chu)了(le)定(ding)(ding)性(xing)結果(guo)外，根據(ju)(ju)qRT-PCR分(fen)析的折疊(die)調節數據(ju)(ju)，還定(ding)(ding)量考(kao)慮了(le)“神(shen)經(jing)組(zu)織構建”中促抗、抗炎、存活(huo)、神(shen)經(jing)元、小(xiao)膠質和大膠質標記基因的上調和下調（圖5）。

與對(dui)照組相比，TNF-α介導的結果是(shi)，隨著TNF-α mRNA的表(biao)達(da)(da)，其(qi)他主(zhu)要促(cu)炎、激(ji)活和(he)/或共刺激(ji)標志物(wu)的表(biao)達(da)(da)水平分別增加，給藥(yao)后，促(cu)炎標志物(wu)較大程度降低。TNF-α組CD86表(biao)達(da)(da)升高3.91倍，TNF-α/EV組在(zai)EV給藥(yao)后CD86表(biao)達(da)(da)降低1.42倍。

另一方面，在炎癥條件(jian)下激活的(de)(de)凋亡標志物Caspase-3的(de)(de)表達水(shui)平在TNF-α組中(zhong)升高，這證明了(le)組織構(gou)建(jian)中(zhong)細胞的(de)(de)損失(shi)，然后由于(yu)EV給(gei)藥的(de)(de)構(gou)建(jian)作用而(er)降低(di)。

圖5：qRT-PCR基因表達和基因富(fu)集分析在(zai)神(shen)經組織芯片(pian)模(mo)型中外泌(mi)體(ti)給藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)抗炎效(xiao)果熱圖顯(xian)示；紅到綠的(de)(de)(de)比例表示Log2倍數變化(hua)的(de)(de)(de)減(jian)少，A:TNF-α處(chu)理(li)的(de)(de)(de)組織與對照組織相比，B: 外泌(mi)體(ti)給藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)TNF-α處(chu)理(li)組織與TNF-α處(chu)理(li)的(de)(de)(de)組織相比（n=2，獨立重復=2）

結論

綜上，在這項研究中(zhong)，我們重點(dian)展(zhan)示了一個由相同(tong)遺(yi)傳背景的分化細胞組成(cheng)的、支持血腦屏障的明確(que)人(ren)源化神經組織芯片模型，該模型更高(gao)通量且具功(gong)能(neng)(neng)性，能(neng)(neng)夠(gou)評估(gu)骨(gu)髓(sui)間充(chong)質干細胞（BMSCs）衍生的細胞外囊(nang)泡(pao)EV的治療潛力，以提出一種治療神經炎癥相關疾病的新(xin)方法。

單一來源的hiPSCs分化神經/膠質細胞的關鍵點可聯系曼博生物獲取原資源。

總部設(she)在芬蘭(lan)奧(ao)盧的器官芯片制造(zao)商AKITA，by Finnfadvance，成(cheng)立于(yu)2019年(nian)。系(xi)統(tong)搭載擁有高通量器官(guan)(guan)芯(xin)片板，該板可(ke)被設計成(cheng)單器官(guan)(guan)和多(duo)器官(guan)(guan)，兼容多(duo)種成(cheng)像模式，高人(ren)體相關性的下一代人(ren)體體外模型，加速藥物(wu)開(kai)發(fa)，降低臨床前(qian)試驗失敗(bai)的風險，也(ye)可(ke)用于個性化醫(yi)療。

上海曼博(bo)生物醫藥(yao)科技有限公司(si)是AKITA，by Finnfadvance官方授(shou)權的中國經銷商。

AKITA工(gong)作流程(cheng)：下圖(tu)(tu)為主要步驟的簡化工(gong)作流程(cheng)圖(tu)(tu)，且每種實驗(yan)都有(you)特定型號的詳細SOP。

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