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引(yin)文

在干細胞治(zhi)療領域中(zhong)，來自(zi)中(zhong)胚層且具備自(zi)我更新(xin)及多項分化潛能(neng)的(de)(de)(de)間充質干細胞已經在臨(lin)床(chuang)應(ying)用(yong)上表現(xian)出巨大(da)的(de)(de)(de)潛力（文獻(xian)參考(kao)1），人(hMSCs)是目前正在進行(xing)的(de)(de)(de)多種適應(ying)癥的(de)(de)(de)臨(lin)床(chuang)試(shi)驗的(de)(de)(de)重(zhong)點(dian)（文獻(xian)參考(kao)2），對于大(da)多數這些臨(lin)床(chuang)適應(ying)癥，需要(yao)體外(wai)擴(kuo)增培養(yang)(yang)細胞提供有效足夠的(de)(de)(de)治(zhi)療劑量(liang)(liang)。因(yin)而建(jian)立合(he)適的(de)(de)(de)體外(wai)hMSCs培養(yang)(yang)擴(kuo)增體系(xi)，實現(xian)大(da)規模(mo)體外(wai)培養(yang)(yang)擴(kuo)增高質量(liang)(liang)的(de)(de)(de)MSCs不僅有利于其功能(neng)分化研究(jiu)，也是MSCs臨(lin)床(chuang)應(ying)用(yong)以及規模(mo)化商業化生產(chan)的(de)(de)(de)關鍵。

MSCs體(ti)外擴增生產(chan)工藝開發的(de)關鍵因素除(chu)了培(pei)(pei)(pei)養(yang)基以(yi)及培(pei)(pei)(pei)養(yang)基補(bu)充(chong)劑(ji)等（關聯閱讀：人血小板裂解物(wu)（hPL）系列分享(xiang)一），培(pei)(pei)(pei)養(yang)方式包括擴增技術和培(pei)(pei)(pei)養(yang)規(gui)模也(ye)格外重要。目前MSCs可以(yi)2D單層平面培(pei)(pei)(pei)養(yang)（最(zui)常見的(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)瓶或者培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)），也(ye)可以(yi)附著在微載體(ti)上進行3D培(pei)(pei)(pei)養(yang)，微載體(ti)的(de)應(ying)用增加了細胞生長的(de)可用表面積。將微載體(ti)與(yu)適當(dang)的(de)生物(wu)反應(ying)器(qi)結合，可大大增強(qiang)的(de)細胞收(shou)獲(huo)能力，減少操作步驟。

小編主(zhu)要分享(xiang)的(de)是：通(tong)過使用添加(jia)了(le)人血小板裂解物(wu)（hPL）的(de)無外(wai)源動物(wu)成份MSCs生(sheng)長培養(yang)基(ji)，成功的(de)在微載體(ti)與生(sheng)物(wu)反應器的(de)3D培養(yang)環境中擴增人骨髓來源間(jian)充質干細胞(hBM-MSC)。

2D培養環境中微載體篩選

為(wei)了(le)確定合適(shi)的(de)微載(zai)體體系(xi)，實(shi)驗人員在微孔(kong)板(ban)的(de)2D環境中(zhong)(zhong)（Corning 6孔(kong)超低吸附板(ban)）篩選了(le)幾(ji)種市面上可用的(de)微載(zai)體Plastic, Plastic Plus, Pronectin F, and Star Plus (Pall, USA)。每(mei)個(ge)(ge)微載(zai)體做三個(ge)(ge)復孔(kong)，培養的(de)三天中(zhong)(zhong)每(mei)天消化每(mei)種微載(zai)體的(de)一個(ge)(ge)孔(kong)的(de)細胞進(jin)行處理和計(ji)數(shu)。

圖1 2D環境中微載(zai)體(ti)篩選(xuan)

最終發現如圖1所示，在小規模的2D環境的微載體篩選實驗發現Plastic,和Pronectin F這兩種微載體相關培養體系中hBM-MSCs細胞具有相對較高的生長能力。

小規模3D培養比較

基(ji)于(yu)上述2D篩(shai)選實驗中(zhong)選擇的(de)(de)兩個性能不錯的(de)(de)微載體Plastic和(he)Pronectin F，在100 mL帶立式旋(xuan)轉輪(lun)的(de)(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶(ping)中(zhong)進(jin)行(xing)小型(xing)3D實驗。用16g/L無菌微載體在100mL 3D培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶(ping)中(zhong)以20rpm培(pei)養(yang)(yang)(yang)hBM-MSCs 9天，第4天和(he)第7天更換培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)。定時取5ml樣品(pin)統計細胞生長曲線（圖2a）。

圖(tu)2 兩種微載體(ti)在小(xiao)型3D培養體(ti)系中的(de)細胞生長情況

通過(guo)將Plastic和Pronectin F在100mL 3D立式(shi)旋轉輪培養(yang)瓶體(ti)系的比較，最終發現如(ru)圖(tu)2所示(shi)：不管(guan)是細(xi)胞生(sheng)長(chang)曲線還是3輪培養(yang)中平均(jun)細(xi)胞收獲能力(li)（細(xi)胞生(sheng)長(chang)密度(du)）Pronectin F都表現最佳，該微載體(ti)3D培養(yang)體(ti)系中hBM-MSCs細(xi)胞有相對較高(gao)的生(sheng)長(chang)能力(li)，因此選(xuan)擇Pronectin F進行下一輪的種子細(xi)胞培養(yang)試驗的候選(xuan)微載體(ti)。

種子培養實驗

圖3 種子培養實驗(yan)流程(cheng)

低溫(wen)保存的hBM-MSCs在T225培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶中(zhong)復蘇擴增，然后(hou)收集10M細(xi)胞接種到(dao)500mL立式(shi)旋轉(zhuan)輪培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶中(zhong)，添(tian)加Pronectin F微(wei)(wei)載體(ti)16g/L，以18 rpm培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)細(xi)胞6-7天(tian)(tian)（第(di)4天(tian)(tian)更換(huan)(huan)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基）。然后(hou)繼續(xu)將收獲大(da)約55-60M的細(xi)胞轉(zhuan)移到(dao)3L生物(wu)反應器系統中(zhong)，添(tian)加16g/L的Pronectin F微(wei)(wei)載體(ti)繼續(xu)細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)11-12天(tian)(tian)（第(di)4天(tian)(tian)和第(di)7天(tian)(tian)更換(huan)(huan)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基）。培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)期(qi)間分別采(cai)集0.5L和3L的細(xi)胞，流式(shi)細(xi)胞儀（FACS）分析(xi)細(xi)胞表面標志物(wu)CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表達(da)情況，并(bing)且收集的細(xi)胞在成脂(zhi)分化培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(Lonza，美國)中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)10天(tian)(tian)，并(bing)用(yong)Oil Red O (Sigma，美國)染色檢(jian)測其分化能力，另外(wai)細(xi)胞接種到(dao)3L生物(wu)反應器中(zhong)后(hou)每3天(tian)(tian)取樣Calcein AM染色在顯微(wei)(wei)鏡下觀察(cha)細(xi)胞生長狀況。

表1：FACS檢(jian)測0.5L和3L體系擴增后(hou)細胞表面抗(kang)原特(te)性

表(biao)(biao)1中FACS分析結果表(biao)(biao)明，兩種3D培養體系中的(de)(de)(de)MSCs均一表(biao)(biao)達了CD73和(he)CD90，而CD34、CD45和(he)HLA-DR等為陰性。圖4顯示從0.5L和(he)3L生物反應器中獲得的(de)(de)(de)細胞(bao)在分化培養基(ji)中培養10天后都出現油紅(hong)O染紅(hong)的(de)(de)(de)脂滴(di)。

圖4：a) 0.5L和b) 3L細(xi)胞在20X顯微成像觀察其(qi)成脂分化。

通(tong)過熒光顯(xian)微鏡觀察生(sheng)(sheng)物(wu)反應器中(zhong)(zhong)微載(zai)體表面(mian)細(xi)(xi)胞貼附生(sheng)(sheng)長情況，如圖5中(zhong)(zhong)顯(xian)示(shi)：接種后細(xi)(xi)胞從最開始(shi)貼附微載(zai)體表面(mian)呈半球形后慢慢開始(shi)舒展至最后長滿微載(zai)體表面(mian)。

圖5 3L生物(wu)反應器(qi)中顯(xian)微(wei)鏡下觀察(cha)細(xi)胞生長狀(zhuang)況

總的(de)(de)(de)來說，種子培(pei)養實驗(yan)通過先在T225中(zhong)(zhong)擴(kuo)增(zeng)數百萬個hBM-MSCs細胞(bao)(bao)，將它(ta)們轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到(dao)500mL的(de)(de)(de)帶(dai)(dai)有Pronectin F微載體的(de)(de)(de)3D培(pei)養體系中(zhong)(zhong)獲得了6倍擴(kuo)增(zeng)，然后再(zai)將細胞(bao)(bao)轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到(dao)3L帶(dai)(dai)立式旋轉(zhuan)(zhuan)輪生物反應器系統中(zhong)(zhong)進行(xing)進一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)13倍擴(kuo)增(zeng)，最終獲得了一(yi)個種子細胞(bao)(bao)組。本(ben)實驗(yan)人(ren)員在經過兩次微載體3D環境體系培(pei)養后，將hBM-MSCs體外擴(kuo)增(zeng)培(pei)養實現了82倍的(de)(de)(de)放大效果，并(bing)且整個擴(kuo)增(zeng)過程中(zhong)(zhong)MSCs維持表型以(yi)及對應分化能力。

因此可(ke)知微載體結合(he)生物反應器3D培養體系(xi)是一種可(ke)行的體外MSCs擴增(zeng)技(ji)術(shu)，再結合(he)優化的培養條件（細胞接種密度、轉速、溶氧(yang)等）可(ke)為臨床應用提供(gong)足夠量的種子(zi)細胞，最(zui)終滿(man)足MSCs臨床應用的需(xu)求(qiu)。

美(mei)國Sexton Biotechnologies專(zhuan)注于(yu)細胞(bao)和(he)基(ji)因治療行(xing)業生產工(gong)具(ju)的(de)(de)開(kai)(kai)發和(he)銷(xiao)售，開(kai)(kai)發了適用于(yu)CGT行(xing)業生產的(de)(de)工(gong)具(ju)和(he)產品，以(yi)(yi)實現細胞(bao)制造(zao)過程(cheng)的(de)(de)靈(ling)活自動(dong)化和(he)規模化，從而(er)提高臨床(chuang)結果成(cheng)功的(de)(de)概率，減少上市時間(jian)和(he)勞(lao)動(dong)力成(cheng)本。Sexton目前(qian)已經商業化的(de)(de)產品包括作為培(pei)養基(ji)補充劑以(yi)(yi)及(ji)血(xue)清替代物(wu)的(de)(de)人血(xue)小(xiao)板裂解液（hPL）以(yi)(yi)及(ji)高通量封(feng)閉式細胞(bao)灌(guan)裝(zhuang)系統等。

美國Sexton無(wu)動(dong)物源人(ren)血(xue)(xue)小板(ban)裂解液hPL已(yi)被上(shang)百篇文獻(xian)報道了美國Sexton公(gong)司的(de)血(xue)(xue)小板(ban)裂解液為間充質(zhi)干細胞(bao)(bao)MSCs以(yi)及(ji)CAR-T/NK細胞(bao)(bao)擴增(zeng)的(de)良好(hao)的(de)細胞(bao)(bao)培養補(bu)充劑(如下圖1-3)，根(gen)據用戶科研(yan)和(he)(he)臨(lin)床(chuang)以(yi)及(ji)GMP生產需求(qiu)，提(ti)供臨(lin)床(chuang)或研(yan)究級配方，同(tong)時滿足質(zhi)量和(he)(he)監管(guan)要(yao)求(qiu)，在(zai)FDA已(yi)經備案藥物主文件BMF，在(zai)全(quan)球臨(lin)床(chuang)干細胞(bao)(bao)和(he)(he)免疫腫瘤學(xue)應用中用作高(gao)性(xing)能(neng)FBS替代品,主要(yao)特點如下：

兼容性：作為(wei)培養基補充(chong)劑，替(ti)代胎牛血清FBS或AB血清，適用(yong)于廣(guang)泛的(de)細胞類型(xing)包括(kuo)MSCs, T細胞，NK細胞，內皮細胞等的(de)培養。

安全性：在ISO9001認證的設施中驗證了病原體的減少，并進行了無菌，支原體和內毒素等測試

重現性：通過匯集來自AABB認證/FDA注冊血液中心的100多名美國人體捐獻者，最大限度地減少了批與批之間的差異

可靠性：AABB認證/FDA注冊官方認證血源

合規性：在(zai)歐洲(zhou)藥典(dian)5.2.12.4章則要求的(de)環(huan)境下生(sheng)產，在(zai)FDA 已進行BMF備案

無需肝素：產品(pin)生產過(guo)程(cheng)和(he)使用過(guo)程(cheng)都無(wu)需添加肝素

易于使用：直接按比例添加入培養基，可選規格100ml和500ml

穩(wen)定供應：上海曼博生(sheng)(sheng)物(wu)作(zuo)為(wei)美國(guo)(guo)Sexton品(pin)牌hPL產品(pin)在中國(guo)(guo)的(de)一級(ji)代理商，為(wei)細(xi)胞(bao)治(zhi)療企業提(ti)供(gong)國(guo)(guo)內細(xi)胞(bao)治(zhi)療企業需要(yao)的(de)長期現貨的(de)hPL，為(wei)臨床以及大(da)規模商業化生(sheng)(sheng)產保駕護航.

圖1 適用于MSCs培養(yang)的Stemulate

圖2 適用(yong)于T/NK免疫細(xi)胞等難培養細(xi)胞的(de)nLiven PR

圖(tu)3 適用于(yu)臨(lin)床商業化生產過程(cheng)中無縫銜接的(de)袋(dai)裝系統(tong)的(de)T-Liven PR