微生理系統用于研究脂肪肝疾病及其對藥物性肝損傷的影響

導讀

來自(zi)藥企(qi)阿斯利康的(de)研究團隊使用CN Bio PhysioMimix 構建脂(zhi)肪肝(gan)模型(xing)并研究脂(zhi)肪肝(gan)模型(xing)下各代謝酶的(de)活性(xing)差異以及多種強肝(gan)毒性(xing)風險(xian)的(de)藥物(wu)對脂(zhi)肪肝(gan)帶來的(de)損傷表現（各指標變化(hua)），本研究證明了MPS平臺(tai)和(he)相關的(de)NAFLD模型(xing)為分析(xi)新化(hua)合物(wu)毒性(xing)譜(pu)，及其在NAFLD患者中引發不(bu)同的(de)DILI，提供有力工具。

研究背景

由于糖尿病，肥胖癥和代謝綜合征的患病率增加，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）現在是發達國家中最常見的慢性肝病（1）。NAFLD的病理學譜是從良性肝脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可能導致肝硬化和肝癌。目前尚無FDA批準的用于治療NAFLD / NASH的藥物，并且明確需要更好的模型來了解這種疾病。

另(ling)外，由于(yu)內在(zai)的(de)代謝(xie)條件(jian)，對于(yu)藥物(wu)誘(you)發的(de)肝(gan)(gan)損(sun)傷（DILI）的(de)潛在(zai)危險因素的(de)認識也日益(yi)提高。NAFLD患者(zhe)的(de)DILI可(ke)以(yi)通過(guo)兩(liang)種不同(tong)的(de)方式惡化：一些藥物(wu)似乎(hu)加重了(le)已有的(de)NAFLD，導致更多的(de)過(guo)度(du)的(de)細(xi)(xi)胞內脂質蓄積，而其(qi)他藥物(wu)則更頻繁地誘(you)發急性(xing)肝(gan)(gan)炎(yan)和肝(gan)(gan)損(sun)（2）。有人提出，肥胖引起藥物(wu)性(xing)急性(xing)肝(gan)(gan)炎(yan)的(de)風(feng)險較高，與幾種細(xi)(xi)胞色素P450（CYP）的(de)活(huo)性(xing)增(zeng)(zeng)加有關(guan)，增(zeng)(zeng)強(qiang)了(le)有毒代謝(xie)產(chan)物(wu)的(de)產(chan)生（2）。當過(guo)量(liang)產(chan)生時，反應性(xing)代謝(xie)產(chan)物(wu)可(ke)引起肝(gan)(gan)氧化應激(ji)，嚴重的(de)線粒體功(gong)能障(zhang)礙和細(xi)(xi)胞溶解。

然而(er)，人(ren)們對這些過程發生(sheng)的(de)(de)機理了解甚(shen)少，并且由于肥(fei)胖病的(de)(de)流行，由脂肪(fang)肝引起(qi)的(de)(de)不(bu)良藥物(wu)反應(ying)變(bian)得越發普遍。因此，我(wo)們開發了一種(zhong)先(xian)進(jin)的(de)(de)體外模型，以探索將DILI和NAFLD鏈接(jie)起(qi)來(lai)的(de)(de)關(guan)系和機制。

研究目標

CN-Bio微(wei)生(sheng)理系統（MPS）已(yi)(yi)開發出一種完整(zheng)的(de)人類(lei)灌(guan)注體外NAFLD模(mo)型，利用3D培養的(de)原(yuan)代人肝(gan)細(xi)胞(bao)（PHH）來模(mo)仿肝(gan)臟的(de)微(wei)體系結構。細(xi)胞(bao)使用高濃度(du)的(de)游離(li)脂肪酸培養長達四(si)周(zhou)，以誘導細(xi)胞(bao)內甘油三酸酯（脂肪）累(lei)積并(bing)模(mo)仿肝(gan)脂肪變(bian)性。研究了該模(mo)型中細(xi)胞(bao)的(de)CYP酶活性變(bian)化，以及已(yi)(yi)知肝(gan)毒性劑在(zai)IC：50濃度(du)附(fu)近給(gei)藥時的(de)影響(xiang)。

材料與方法

冷凍保存的(de)可種板的(de)原(yuan)代(dai)人肝(gan)細胞（PHH）來自(zi)ThermoFisher（美國(guo)）。將(jiang)0.6 x 106的(de)肝(gan)細胞接種到PhysioMimix OOC LC-12板的(de)每個孔中（CN Bio Innovations Ltd）上(shang)，并在HEP-Lean或HEP-Fat培(pei)養基中進行培(pei)養，HEP-Fat培(pei)養基含有與生理相關的(de)葡(pu)萄糖，胰島(dao)素(su)以及(ji)高濃度的(de)飽(bao)和(he)和(he)不飽(bao)和(he)游離脂(zhi)肪(fang)酸。在PhysioMimix平臺(tai)上(shang)培(pei)養細胞長(chang)達(da)18天（圖(tu) 1）。

圖1 – 人源體外MPS NAFLD模型

A）體(ti)外模(mo)型(xing)利(li)用(yong)PhysioMimix OOC細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)系統(tong)，該系統(tong)使用(yong)開(kai)放(fang)孔(kong)板設計(ji)，用(yong)于在(zai)工(gong)程支(zhi)(zhi)架中以3D方式(shi)培(pei)(pei)養(yang)原代肝(gan)細(xi)胞。B）在(zai)LC-12肝(gan)芯片(pian)板上的單個培(pei)(pei)養(yang)孔(kong)的示意圖。C）LC-12多(duo)孔(kong)板的示意圖。D）在(zai)整個實(shi)驗過程中，將(jiang)持續(xu)對(dui)固定在(zai)平板上每個孔(kong)中的支(zhi)(zhi)架連續(xu)灌注(zhu)細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)基，以提供生物(wu)力學刺激和氧氣供應(ying)（3）。E）通過在(zai)高脂肪培(pei)(pei)養(yang)基中培(pei)(pei)養(yang)PHH長達28天來生成(cheng)NAFLD模(mo)型(xing)。為了(le)研究DILI，在(zai)負載脂肪14天后才(cai)給(gei)與化合物(wu)劑量。

通(tong)(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)固定(ding)(ding)(ding)的微組織的Oil Red O染色測(ce)(ce)量(liang)脂(zhi)肪(fang)積累(lei)，并在(zai)Nikon Eclipse Ti-E倒(dao)置熒光顯微鏡(jing)上(shang)采集圖像（圖 2）。通(tong)(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)在(zai)515nm處(chu)的吸光度對染色進(jin)行定(ding)(ding)(ding)量(liang)并且將(jiang)其與通(tong)(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)BCA測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)法（ThermoFisher）測(ce)(ce)量(liang)的總蛋白(bai)質含量(liang)進(jin)行歸一化處(chu)理。通(tong)(tong)(tong)(tong)過(guo)(guo)ELISA（R＆D systems）測(ce)(ce)量(liang)白(bai)蛋白(bai)的產(chan)生(sheng)，使用Cyto-tox96測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)法（Promega）定(ding)(ding)(ding)量(liang)LDH釋放(fang)，并使用Cell Titre Glo測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)法（Promega）評估(gu)細胞活力。

圖2 – 人源原(yuan)代肝(gan)細胞隨(sui)時間積(ji)累細胞內脂肪。

在高(gao)脂肪培養基中培養的那(nei)些(xie)顯示出改(gai)變的基因表達譜。

PHH在高脂(zhi)和無脂(zhi)條件下培(pei)養14天。通(tong)(tong)過微組織(zhi)的(de)Oil Red O染色測量脂(zhi)肪(fang)負荷，并(bing)使用Liver RT2 Profiler PCR Arrays比較基因表(biao)達(da)。A）對細胞(bao)進(jin)行細胞(bao)內脂(zhi)肪(fang)積累(lei)成像，B）通(tong)(tong)過在510 nm處的(de)吸(xi)光度進(jin)行定量，并(bing)與總蛋白質含量標(biao)準化處理。C）通(tong)(tong)過ELISA定量白蛋白產生，并(bing)且低脂(zhi)和高脂(zhi)培(pei)養之間的(de)基因表(biao)達(da)變(bian)(bian)化D）通(tong)(tong)過倍數(shu)(shu)變(bian)(bian)化＞ 1.8和P ＝ ＜0.05來劃定標(biao)準。E）高脂(zhi)與低脂(zhi)條件下關鍵基因表(biao)達(da)的(de)倍數(shu)(shu)變(bian)(bian)化。數(shu)(shu)據是來自9個(ge)獨立培(pei)養物的(de)mean±SEM（每種(zhong)情況三個(ge)供(gong)體，每個(ge)供(gong)體n = 3個(ge)樣品）；* ＝ P ＜0.05。數(shu)(shu)據取自Kostrzewski等(deng)以(yi)前(qian)的(de)發表(biao)文獻2017（3）。

對(dui)(dui)于(yu)轉錄組(zu)分析(xi)，使(shi)用(yong)TRIzol從支架中提取總(zong)RNA。使(shi)用(yong)對(dui)(dui)脂肪肝(gan)疾病相(xiang)關(guan)基因具有特異性的(de)RT2分析(xi)儀陣列（Qiagen）生成(cheng)并比較cDNA樣(yang)品(pin)(pin)。使(shi)用(yong)兩(liang)種方法(fa)評估CYP活性；使(shi)用(yong)CYP3A-glo實(shi)驗（Promega）或使(shi)用(yong)LC-MS定(ding)量(liang)特定(ding)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)濃度。簡(jian)而言之，將細胞(bao)暴露于(yu)一系列對(dui)(dui)不同CYP-450酶(mei)具有特異性的(de)化(hua)合物(wu)(wu)(wu)。使(shi)用(yong)了(le)以下化(hua)合物(wu)(wu)(wu)：非(fei)那西丁(ding)(ding)（CYP1A2），雙氯(lv)芬酸（CYP2C9），S-甲吩妥英（CYP2C19），丁(ding)(ding)呋洛爾(er)（CYP2D6），咪達(da)唑侖（CYP3A4）和氯(lv)唑酮（CYP2E1）。每種化(hua)合物(wu)(wu)(wu)按照(zhao)1 μM的(de)起始濃度將給藥(yao)48小時，使(shi)用(yong)0.1％DMSO作為溶(rong)劑(ji)。使(shi)用(yong)LC-MS從細胞(bao)培養基樣(yang)品(pin)(pin)中定(ding)量(liang)每種化(hua)合物(wu)(wu)(wu)的(de)phase I代謝產物(wu)(wu)(wu)的(de)產量(liang)。

研究結果

01  NAFLD模型中的肝細胞改變了代謝活性

圖3 - PHH在高(gao)脂條(tiao)件下(xia)培養14天，然后(hou)加入探(tan)針(zhen)化合(he)物(wu)以評估關鍵CYP-450酶的(de)(de)代謝(xie)活性(xing)。通過在48小時內(nei)產(chan)生(sheng)phase I代謝(xie)產(chan)物(wu)來確定(ding)每種酶的(de)(de)活性(xing)。使用(yong)LC-MS和(he)代謝(xie)物(wu)的(de)(de)標準曲(qu)線定(ding)量代謝(xie)物(wu)的(de)(de)存在。各化合(he)物(wu)均(jun)在第14天給藥，除(chu)了(le)CLZX（CYP2E1目標）是在第7天給藥。各數據均(jun)為至(zhi)少(shao)n = 3。* = P <0.05。

02  確定已知引起DILI的化合物的IC：50濃度

圖4 - 在(zai)低脂培養基條件下(xia)，將PHH在(zai)膠原蛋白包被的(de)96孔板上培養72小(xiao)(xiao)時。在(zai)使用Cell Titre Glo評估細胞(bao)活(huo)力之前，將它(ta)們暴露(lu)于不同濃度的(de)A）對乙(yi)酰(xian)氨基酚，B）甲氨蝶呤和C）噻氯匹(pi)定48小(xiao)(xiao)時。D）生成每(mei)種化合物(wu)的(de)IC：50值并將其與公(gong)開數(shu)據(ju)進(jin)行比較(jiao)（4）。所(suo)示數(shu)據(ju)為(wei)mean±SD，最. 小(xiao)(xiao)為(wei)N = 4。

03  肝細胞的脂肪負荷增加了對乙酰氨基酚和噻氯匹定引起的DILI敏感性

圖5 - PHH在(zai)高脂(zhi)條件下培(pei)養14天，然后(hou)在(zai)以前測定(ding)的(de)IC：50濃度附近加入化(hua)合(he)物(wu)(wu)。向PHH微(wei)組(zu)織(zhi)中(zhong)按每種化(hua)合(he)物(wu)(wu)單次(ci)48小(xiao)時(shi)或兩次(ci)48小(xiao)時(shi)（多次(ci)）劑(ji)量給(gei)藥。各化(hua)合(he)物(wu)(wu)給(gei)藥均稀釋(shi)在(zai)含有0.1％DMSO溶劑(ji)的(de)低脂(zhi)培(pei)養基(ji)中(zhong)。對照低脂(zhi)和高脂(zhi)微(wei)組(zu)織(zhi)僅用溶劑(ji)給(gei)藥。通過測量在(zai)細(xi)胞培(pei)養基(ji)中(zhong)的(de)LDH釋(shi)放，在(zai)細(xi)胞培(pei)養基(ji)中(zhong)白蛋白的(de)產生并在(zai)給(gei)藥不同化(hua)合(he)物(wu)(wu)后(hou)確定(ding)肝細(xi)胞的(de)CYP3A4活性來評估細(xi)胞健康。數(shu)據為mean±SD，n =4。* = P <0.05。

結論

利用MPS平(ping)臺PhysioMimix，我們生成了(le)NAFLD的(de)(de)人源體(ti)外(wai)模(mo)型(xing)。PHH在含脂(zhi)肪(fang)的(de)(de)培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)，該培(pei)養(yang)基(ji)誘(you)導了(le)臨(lin)床疾病早期階段的(de)(de)關(guan)鍵特征，包括(kuo)細(xi)胞內(nei)脂(zhi)肪(fang)負載(zai)，白蛋白產生增(zeng)加(jia)和關(guan)鍵基(ji)因(yin)表達(da)的(de)(de)變(bian)化（包括(kuo)那些(xie)(xie)與代謝和胰島素抵抗有關(guan)的(de)(de)基(ji)因(yin)）。我們進(jin)一步調查了(le)脂(zhi)肪(fang)負載(zai)后PHH的(de)(de)代謝活性(xing)(xing)，以(yi)確定(ding)CYP酶的(de)(de)活性(xing)(xing)如何被細(xi)胞內(nei)脂(zhi)質累積所(suo)調節。模(mo)仿(fang)體(ti)內(nei)（臨(lin)床）觀察結果（2），我們看到各(ge)種(zhong)酶的(de)(de)增(zeng)加(jia)，包括(kuo)：CYP1A2，CYP2C9（1.5倍），CYP2C19（2倍）和CYP2E1（2.5倍）活性(xing)(xing)。此(ci)外(wai)，我們觀察到脂(zhi)肪(fang)負荷后CYP3A4活性(xing)(xing)略有降低。通過評估對(dui)乙酰(xian)氨基(ji)酚，噻氯匹定(ding)和甲氨蝶(die)呤在體(ti)外(wai)NAFLD模(mo)型(xing)中的(de)(de)毒性(xing)(xing)，探討了(le)這些(xie)(xie)代謝變(bian)化對(dui)肝細(xi)胞對(dui)DILI的(de)(de)敏(min)感性(xing)(xing)的(de)(de)影響(xiang)。

對乙(yi)酰氨(an)基酚和噻氯匹定在(zai)脂肪負載的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)中引(yin)起更多(duo)的(de)(de)(de)(de)過(guo)度(du)的(de)(de)(de)(de)DILI反應，導致LDH釋放增加，減少白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)產生并降低CYP3A4活性（作為(wei)細胞(bao)(bao)活力的(de)(de)(de)(de)一種度(du)量(liang)）。當(dang)化合物多(duo)次給藥(yao)到肝(gan)組織上時，這些變化通常更為(wei)明. 顯。在(zai)負載脂肪的(de)(de)(de)(de)肝(gan)細胞(bao)(bao)存在(zai)下(xia)，甲氨(an)蝶呤給藥(yao)似乎不會(hui)引(yin)起DILI。這些數(shu)據共同證明了MPS平臺(tai)和相關(guan)的(de)(de)(de)(de)NAFLD模型如何捕捉早期階(jie)段的(de)(de)(de)(de)關(guan)鍵特征，并展現(xian)出臨床(chuang)上觀察到的(de)(de)(de)(de)對于DILI的(de)(de)(de)(de)一系列反應。

該方法將是用于分析新型化合物的毒(du)性特征及其在不同患者亞(ya)群中(zhong)的行為方式(shi)（引(yin)起DILI）的實用工具(ju)。

拓展閱讀

1.CN-Bio器官芯片系(xi)統應用--藥(yao)物毒(du)理(li)學(xue)評(ping)價

2.通過(guo)器官芯片的(de)預測能(neng)力降低藥物性(xing)肝損傷(shang)的(de)風險

3.人源器官(guan)芯片系統用(yong)于(yu)體外研究急性和慢性的藥(yao)物引起的肝毒性

主要參考文獻

1.Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, et al. Nat Med 2018;24:908-922.

2.Fromenty B. Drug-induced liver injury in obesity. J Hepatol 2013;58:824-6.

3.Kostrzewski T, Cornforth T, Snow SA, et al. World Journal of Gastroenterology 2017;23:204-215.

4.Proctor WR, Foster AJ, Vogt J, et al. Arch Toxicol 2017;91:2849-2863.

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