本文主要介紹使用肝臟微生理系統評估藥物毒性、代謝和積累的可重復性特征。

導讀

來(lai)自美國藥監局（FDA）藥物評估(gu)和(he)研究中心的(de)(de)研究團隊，使(shi)用CN Bio的(de)(de)PhysioMimix 微流(liu)控器官芯片(pian)系(xi)統（MPS&OOC）構(gou)建肝(gan)模型(xing)(xing)，評估(gu)肝(gan)MPS在(zai)藥物毒性(xing)、代(dai)謝和(he)細胞內積累(lei)方面(mian)的(de)(de)可行性(xing)、準確性(xing)、一致性(xing)、重現性(xing)，并與傳(chuan)統的(de)(de)球體、三明治培(pei)養(yang)平(ping)臺做(zuo)對比，發現不同培(pei)養(yang)平(ping)臺在(zai)肝(gan)的(de)(de)關(guan)鍵指(zhi)標上存在(zai)較(jiao)為(wei)明顯的(de)(de)差異(yi)，結(jie)果證明肝(gan)MPS模型(xing)(xing)更具人體相關(guan)性(xing)，更適用于代(dai)謝、毒性(xing)、積累(lei)的(de)(de)定量研究，并提(ti)出了(le)一些建議與考慮。

研究背景及亮點

1、這項技術是(shi)什么？

微生(sheng)理(li)系統(tong)（MPS）被設計(ji)用于重現器(qi)官或(huo)組織特(te)定的(de)細(xi)胞(bao)(bao)外微環境(jing)特(te)征，增(zeng)強培(pei)養(yang)中(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)生(sheng)理(li)相關(guan)性(xing)。肝MPS通(tong)過以(yi)3D方式培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)(bao)并將(jiang)其暴露于連續液流中(zhong)，實現了對肝細(xi)胞(bao)(bao)的(de)長期和穩(wen)定培(pei)養(yang)。

2、這項(xiang)研究解決了什么問(wen)題？

相(xiang)對于(yu)其他細胞培養平臺，以及肝MPS在評估藥物開發和評估問題（如(ru)毒性(xing)、代(dai)謝和藥代(dai)動力學）方面的可重復(fu)性(xing)，其功能(neng)性(xing)表現如(ru)何？

3、這項研(yan)究對(dui)我們的知識有何補(bu)充？

肝(gan)MPS系(xi)(xi)統(tong)地(di)(di)檢測到了曲(qu)(qu)伐沙(sha)星（trovafloxacin）的(de)(de)毒性。與球體和(he)(he)三明(ming)治培養(yang)相比，該系(xi)(xi)統(tong)具有更穩定的(de)(de)功(gong)能(neng)，并(bing)對曲(qu)(qu)格列酮(tong)（troglitazone）、他莫西(xi)芬（tamoxifen）和(he)(he)地(di)(di)高辛（digoxin）具有不同的(de)(de)敏感性。對曲(qu)(qu)格列酮(tong)的(de)(de)二(er)相代謝和(he)(he)氯喹的(de)(de)胞(bao)內積累進行定量(liang)分析(xi)顯(xian)示了肝(gan)MPS用(yong)于(yu)研究藥物代謝和(he)(he)藥代動力學的(de)(de)潛(qian)在用(yong)途(tu)。對評估芯片功(gong)能(neng)的(de)(de)質量(liang)控制標準對可靠使用(yong)肝(gan)MPS至關重要。

4、這(zhe)將如何改變臨(lin)床藥(yao)理學(xue)或轉化(hua)科學(xue)？

由于(yu)其功能強(qiang)大和生理(li)相(xiang)關性(xing)（3D培(pei)養(yang)、細(xi)胞暴露(lu)于(yu)連續液流以(yi)及(ji)不(bu)同(tong)細(xi)胞類(lei)型的共培(pei)養(yang)），肝MPS可以(yi)以(yi)可重復(fu)的方式：

（i）檢測由炎癥引起(qi)的藥物(wu)毒性，正如(ru)曲非奎新所證明(ming)的

（ii）檢(jian)測其他(ta)藥物的毒性，如曲格(ge)列酮、他(ta)莫西芬和地高辛，具(ju)有不同于球體和三明治培養中檢(jian)測到的效果

（iii）進行(xing)依賴于細胞活動的(de)(de)延長的(de)(de)肝功能研究，以及（iv）檢測二相代(dai)謝產物(wu)和藥(yao)物(wu)積累，從(cong)而可能支持對臨(lin)床(chuang)數據的(de)(de)解釋。在藥(yao)物(wu)開發中整合MPS將通過對性能和可重復性的(de)(de)仔細評估得到促(cu)進，正如(ru)本研究所進行(xing)的(de)(de)評估。

總體目標

測(ce)試肝MPS在可重(zhong)復預測(ce)藥物(wu)(wu)肝毒性、分析藥物(wu)(wu)代謝和(he)胞(bao)內藥物(wu)(wu)積累方面的(de)性能。

1、首先通過使用曲伐沙(sha)星證明了肝(gan)MPS在檢測(ce)肝(gan)毒性(xing)物質方面的可(ke)重復性(xing)。

2、將其(qi)(qi)與其(qi)(qi)他(ta)肝培養格式進行比(bi)較，以了(le)解它們對其(qi)(qi)他(ta)有毒物質和功能(neng)性的響應。

3、使用(yong)(yong)曲格列酮、雙氯芬酸(suan)和氯喹評估了肝MPS用(yong)(yong)于藥物代謝、清除和分布研究的能力。

4、評估質量控制(zhi)標準(zhun)的適當使用，以確保從MPS研究中生成可重復的數據(ju)。

研究結果

1、MPS在(zai)不(bu)同實驗場地和不(bu)同批次kupffer細(xi)胞的結果一致(zhi)性

測(ce)試在(zai)兩(liang)個地點使(shi)用(yong)(yong)肝(gan)臟MPS或使(shi)用(yong)(yong)兩(liang)批不同的(de)(de)(de)PHKCs（每批的(de)(de)(de)批號(hao)在(zai)補充材料(liao)中）是(shi)否(fou)會導(dao)致相同實驗之間的(de)(de)(de)結(jie)果(guo)差(cha)異，并將(jiang)PHHs與PHKCs共培養(yang)，暴露于trovafloxaci（T，特異性(xing)肝(gan)毒(du)性(xing)）和levofloxacin（L，肝(gan)毒(du)性(xing)風險(xian)較(jiao)低）。圖(tu)1a-c表明，兩(liang)個實驗地點都能(neng)觀(guan)察(cha)到(dao)，100μM trovafloxacin和LPS處理的(de)(de)(de)樣本觀(guan)察(cha)到(dao)LDH水平超過基(ji)線(xian)(xian)的(de)(de)(de)4倍(bei)，而(er)當LPS沒有與trovafloxacin共用(yong)(yong)時，未檢測(ce)到(dao)LDH產生與對照相比的(de)(de)(de)顯(xian). 著差(cha)異，無(wu)(wu)論有無(wu)(wu)levofloxacin，LPS都將(jiang)CYP3A4活性(xing)降低到(dao)基(ji)線(xian)(xian)以下(xia)的(de)(de)(de)50%。然而(er)，100μM的(de)(de)(de)trovafloxacin，無(wu)(wu)論是(shi)否(fou)有LPS，都進一步將(jiang)CYP3A4活性(xing)降低到(dao)基(ji)線(xian)(xian)以下(xia)的(de)(de)(de)10%，這(zhe)些結(jie)果(guo)與PHKCs的(de)(de)(de)批次無(wu)(wu)關。

圖(tu)1：使用(yong)在(zai)(zai)肝MPS中(zhong)與(yu)PHKCs共培養的(de)(de)(de)PHHs在(zai)(zai)兩(liang)個不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)和(he)兩(liang)個經過驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)證的(de)(de)(de)PHKCs批(pi)次中(zhong)檢(jian)測到(dao)的(de)(de)(de)曲伐沙星的(de)(de)(de)毒性(xing)效應(ying)。A.實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)位(wei)于(yu)英(ying)國(guo)劍橋的(de)(de)(de)CN Bio Innovations，B.實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)位(wei)于(yu)美國(guo)馬里蘭(lan)州銀泉的(de)(de)(de)FDA實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)室。在(zai)(zai)肝MPS的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)培養基中(zhong)添加曲伐沙星（T）和(he)左(zuo)氧氟沙星（L）濃度為25或100 μM，在(zai)(zai)存在(zai)(zai)（+）或不(bu)(bu)存在(zai)(zai)（?）1 μg/ml脂多糖（LPS）的(de)(de)(de)情(qing)況下激活PHKCs。暴露2天后，通過測量LDH（a–c）和(he)CYP3A4活性(xing)（d–f）在(zai)(zai)細胞(bao)(bao)培養基中(zhong)估(gu)計(ji)細胞(bao)(bao)死亡。方框表(biao)示平均值，誤差條(tiao)表(biao)示SEM。在(zai)(zai)A實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)（a，d）和(he)B實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)（b，e）之間(jian)使用(yong)相同(tong)批(pi)次的(de)(de)(de)PHHs和(he)PHKCs。B實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)還(huan)使用(yong)了(le)另一(yi)批(pi)PHKCs（c，f）。對(dui)(dui)于(yu)每組結果，*p < 0.005和(he)**p < 0.05，采(cai)用(yong)不(bu)(bu)配對(dui)(dui)t檢(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)和(he)Welch校正。*和(he)**在(zai)(zai)柱子上方表(biao)示相對(dui)(dui)于(yu)控(kong)制(zhi) -LPS的(de)(de)(de)差異的(de)(de)(de)統(tong)計(ji)顯(xian). 著性(xing)。除非另有說明，否(fou)則所(suo)呈現條(tiao)件的(de)(de)(de)值之間(jian)的(de)(de)(de)差異與(yu)控(kong)制(zhi) -LPS的(de)(de)(de)值之間(jian)在(zai)(zai)統(tong)計(ji)上不(bu)(bu)同(tong)。對(dui)(dui)于(yu)（e）和(he)（f），還(huan)呈現了(le)T25 +LPS條(tiao)件和(he)其他條(tiao)件之間(jian)差異的(de)(de)(de)統(tong)計(ji)顯(xian). 著性(xing)，例(li)如T100 +LPS（e，f）和(he)T100 -LPS（e）。每個條(tiao)件使用(yong)三個不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)孔，除了(le)在(zai)(zai)A實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)場(chang)地(di)(di)進行的(de)(de)(de)實(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)中(zhong)，條(tiao)件L100 +LPS和(he)T100 +LPS使用(yong)了(le)4個孔。LDH，乳酸脫氫(qing)酶；MPS，微生理系(xi)統(tong)；PHHs，原代人(ren)類(lei)(lei)肝細胞(bao)(bao)；PHKCs，原代人(ren)類(lei)(lei)庫普弗細胞(bao)(bao)。

2、在肝臟MPS中(zhong)培養的PHHs表現出對肝毒素的不(bu)同敏(min)感性

為了確定在(zai)肝臟MPS中(zhong)維(wei)持的(de)(de)(de)(de)PHHs相(xiang)(xiang)對(dui)(dui)于(yu)球(qiu)狀(zhuang)體(ti)(ti)或(huo)三(san)明(ming)(ming)治(zhi)(zhi)培養(yang)(yang)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)是否對(dui)(dui)肝毒素(su)的(de)(de)(de)(de)敏(min)感性(xing)(xing)發生(sheng)了改變，所有三(san)個(ge)(ge)平(ping)臺都暴露于(yu)troglitazone、tamoxifen和digoxin的(de)(de)(de)(de)不同(tong)濃度（圖(tu)S2）。這(zhe)些肝毒素(su)對(dui)(dui)LDH產(chan)生(sheng)、CYP3A4活性(xing)(xing)和白蛋(dan)白產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)濃度依賴性(xing)(xing)效應在(zai)圖(tu)2中(zhong)為每個(ge)(ge)平(ping)臺顯(xian)示。總的(de)(de)(de)(de)來說，結果顯(xian)示PHHs對(dui)(dui)這(zhe)些肝毒素(su)的(de)(de)(de)(de)敏(min)感性(xing)(xing)取(qu)決(jue)于(yu)使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)平(ping)臺。使(shi)用(yong)肝臟MPS培養(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)表現出(chu)(chu)對(dui)(dui)troglitazone（MPS，EC50 = 210.9 ± 107.8 μM；球(qiu)狀(zhuang)體(ti)(ti)，EC50 = 67.1 ± 13.6 μM；三(san)明(ming)(ming)治(zhi)(zhi)培養(yang)(yang)，EC50 = 35.1 ± 22.2 μM）和tamoxifen（MPS，EC50 = 36.7 ± 3.0 μM；球(qiu)狀(zhuang)體(ti)(ti)，EC50 = 13.7 ± 2.4 μM；三(san)明(ming)(ming)治(zhi)(zhi)培養(yang)(yang)，EC50 = 23.8 ± 14.8 μM）的(de)(de)(de)(de)更(geng)高抵抗力。相(xiang)(xiang)反(fan)，肝臟MPS中(zhong)維(wei)持的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)表現出(chu)(chu)對(dui)(dui)digoxin的(de)(de)(de)(de)抵抗程(cheng)度與三(san)明(ming)(ming)治(zhi)(zhi)培養(yang)(yang)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)相(xiang)(xiang)似（MPS，EC50 = 84.4 ± 30.8 μM；三(san)明(ming)(ming)治(zhi)(zhi)培養(yang)(yang)，EC50 = 122.3 ± 17.3 μM），而球(qiu)狀(zhuang)體(ti)(ti)中(zhong)培養(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)對(dui)(dui)digoxin更(geng)敏(min)感（球(qiu)狀(zhuang)體(ti)(ti)，EC50 = 6.4 ± 0.9 μM）。

圖2：展示(shi)(shi)了(le)(le)(le)LDH釋放（粉紅色(se)(se)圓(yuan)圈）、CYP34A活(huo)性（橙色(se)(se)方塊）和白(bai)蛋白(bai)產生（綠色(se)(se)三(san)(san)(san)(san)角形）對(dui)48小(xiao)(xiao)時(shi)內(nei)暴露于troglitazone、tamoxifen和digoxin的(de)(de)一(yi)系(xi)列(lie)濃(nong)度(du)的(de)(de)反應，這在所(suo)有3個(ge)平臺上(shang)(shang)都有：肝臟MPS、球狀體和三(san)(san)(san)(san)明(ming)治(zhi)培養。所(suo)有濃(nong)度(du)范(fan)圍大約覆蓋了(le)(le)(le)三(san)(san)(san)(san)個(ge)數量級，上(shang)(shang)下濃(nong)度(du)限制(zhi)被選定為(wei)包含(han)每個(ge)平臺-藥(yao)物條件下所(suo)有三(san)(san)(san)(san)種(zhong)反應的(de)(de)半(ban)最. 大抑(yi)制(zhi)濃(nong)度(du)。反應被歸一(yi)化為(wei)最. 低藥(yao)物濃(nong)度(du)（對(dui)于LDH來(lai)說是最. 高(gao)）的(de)(de)記(ji)錄(lu)值(zhi)，并以任意(yi)單位(wei)的(de)(de)小(xiao)(xiao)數值(zhi)呈現(xian)。每個(ge)數據點代表三(san)(san)(san)(san)個(ge)生物重(zhong)復(fu)(fu)(fu)的(de)(de)平均值(zhi)，誤差線表示(shi)(shi)SEM，如果(guo)比符號(hao)的(de)(de)大小(xiao)(xiao)短則不呈現(xian)。一(yi)個(ge)MPS孔的(de)(de)三(san)(san)(san)(san)個(ge)技術(shu)重(zhong)復(fu)(fu)(fu)的(de)(de)結(jie)果(guo)對(dui)800 μM的(de)(de)troglitazone進(jin)行了(le)(le)(le)呈現(xian)。一(yi)個(ge)MPS孔的(de)(de)白(bai)蛋白(bai)測量的(de)(de)三(san)(san)(san)(san)個(ge)技術(shu)重(zhong)復(fu)(fu)(fu)的(de)(de)結(jie)果(guo)對(dui)6.25 nM的(de)(de)digoxin進(jin)行了(le)(le)(le)呈現(xian)。LDH，乳酸(suan)脫氫酶；MPS，微生理系(xi)統。

在肝(gan)臟(zang)MPS和球狀體培養中，CYP3A4活性和白(bai)蛋白(bai)產生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)減少(shao)發(fa)生(sheng)(sheng)在LDH產生(sheng)(sheng)增加的(de)(de)(de)肝(gan)毒(du)素濃度以下（表1）。這(zhe)些結果(guo)表明，肝(gan)功能(neng)的(de)(de)(de)喪失可以在細(xi)胞死亡(wang)之前發(fa)生(sheng)(sheng)。LDH、CYP3A4和白(bai)蛋白(bai)終(zhong)點獲得(de)的(de)(de)(de)劑(ji)量-毒(du)性曲線(xian)在肝(gan)臟(zang)MPS和其他兩個平(ping)臺之間通(tong)常具有良好(hao)的(de)(de)(de)相關性。在所有測試的(de)(de)(de)毒(du)素中，troglitazone的(de)(de)(de)效應在平(ping)臺之間以及在同一平(ping)臺的(de)(de)(de)終(zhong)點之間變化最. 大。這(zhe)些結果(guo)表明，每個平(ping)臺/獨特(te)的(de)(de)(de)微環境可能(neng)會不同地影響肝(gan)功能(neng)和毒(du)性。

表1：估計的(de)(de)(de)濃度值(zhi)，這些值(zhi)產生(sheng)LDH的(de)(de)(de)量(liang)、CYP3A4活性和(he)白(bai)蛋(dan)白(bai)分泌的(de)(de)(de)EC50變化，當在不同平臺（肝(gan)(gan)臟MPS、球狀體和(he)三明治培(pei)養(yang)(yang)）中培(pei)養(yang)(yang)的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)細胞(bao)暴露于troglitazone、tamoxifen和(he)digoxin的(de)(de)(de)不同濃度時(shi)。EC50值(zhi)的(de)(de)(de)SEM是從每個功能(neng)終點(dian)對(dui)肝(gan)(gan)毒素的(de)(de)(de)不同濃度的(de)(de)(de)變化計算的(de)(de)(de)。*-最. 大(da)值(zhi)設(she)為(wei)1以計算此值(zhi)。呈現(xian)的(de)(de)(de)相關(guan)參(can)數r是從非(fei)參(can)數Spearman相關(guan)測(ce)試計算的(de)(de)(de)，相對(dui)于肝(gan)(gan)臟MPS中的(de)(de)(de)相應(ying)類型(xing)的(de)(de)(de)反(fan)(fan)應(ying)，為(wei)每種(zhong)類型(xing)的(de)(de)(de)反(fan)(fan)應(ying)（LDH，CYP3A4和(he)白(bai)蛋(dan)白(bai)）計算的(de)(de)(de)。縮寫：EC50，半最. 大(da)有效濃度；LDH，乳(ru)酸(suan)脫氫酶；MPS，微生(sheng)理系統(tong)。

3、相較于其(qi)他(ta)培養平臺(tai)，肝臟(zang)MPS中的PHH細胞功能更(geng)穩定

為了(le)確(que)定(ding)肝(gan)(gan)臟(zang)MPS PHHs對(dui)(dui)肝(gan)(gan)毒素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)敏感性(xing)(xing)(xing)改(gai)變(bian)是否(fou)可(ke)能(neng)是由于(yu)它們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)穩定(ding)性(xing)(xing)(xing)隨(sui)時(shi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)改(gai)變(bian)，我們(men)在沒有肝(gan)(gan)毒素(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下連續監(jian)測(ce)了(le)每(mei)個培(pei)養(yang)平(ping)臺(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)和(he)白蛋白產生。如(ru)預期(qi)，所有測(ce)試的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)臺(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)（圖(tu)3a,b）在初始測(ce)量(liang)后隨(sui)時(shi)間(jian)減少。然而，變(bian)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)倍數在平(ping)臺(tai)之間(jian)是不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，當(dang)歸一(yi)化(hua)(hua)(hua)到從細胞裂解物中(zhong)(zhong)定(ding)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋白質含量(liang)（圖(tu)3a）或種植(zhi)細胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)數（圖(tu)3b）時(shi)，球狀(zhuang)體中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)與其他平(ping)臺(tai)發散。相對(dui)(dui)于(yu)三(san)明(ming)治培(pei)養(yang)，球狀(zhuang)體中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)較(jiao)高，并且在歸一(yi)化(hua)(hua)(hua)到種植(zhi)細胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數量(liang)（圖(tu)3b）時(shi)，在MPS活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)范圍內，而不(bu)是裂解蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)（圖(tu)3a）。盡(jin)管在相對(dui)(dui)球狀(zhuang)體活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)歸一(yi)化(hua)(hua)(hua)策(ce)略之間(jian)存(cun)在分歧，但(dan)肝(gan)(gan)臟(zang)MPS中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)比其他平(ping)臺(tai)降低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)速率較(jiao)慢(man)。

為(wei)了進一步評(ping)估PHH培(pei)(pei)(pei)養(yang)的(de)功能穩定性(xing)，從每種(zhong)類型的(de)細(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養(yang)平(ping)臺測量了白蛋(dan)白產(chan)生(sheng)，直到(dao)培(pei)(pei)(pei)養(yang)的(de)第(di)(di)19天，并歸(gui)(gui)一化到(dao)實驗后(hou)裂解的(de)細(xi)胞(bao)蛋(dan)白的(de)量（圖3c）或種(zhong)植細(xi)胞(bao)的(de)數量（圖3d）。在白蛋(dan)白產(chan)生(sheng)中(zhong)(zhong)，當歸(gui)(gui)一化到(dao)種(zhong)植細(xi)胞(bao)的(de)數量時，球(qiu)狀體和三明治(zhi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)在第(di)(di)3天相對于(yu)MPS呈(cheng)現出更(geng)高的(de)值。獨立(li)于(yu)歸(gui)(gui)一化策略(lve)，球(qiu)狀體和三明治(zhi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)中(zhong)(zhong)的(de)白蛋(dan)白值隨著(zhu)培(pei)(pei)(pei)養(yang)時間的(de)推(tui)(tui)移而(er)(er)減少，而(er)(er)在MPS中(zhong)(zhong)則增(zeng)加。三明治(zhi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)中(zhong)(zhong)的(de)白蛋(dan)白在10天內(nei)降(jiang)(jiang)低到(dao)最. 低水平(ping)，在球(qiu)狀體中(zhong)(zhong)的(de)12天內(nei)降(jiang)(jiang)低到(dao)第(di)(di)3天水平(ping)的(de)50%以(yi)下。相比之下，白蛋(dan)白產(chan)生(sheng)在第(di)(di)3天后(hou)的(de)MPS中(zhong)(zhong)隨著(zhu)時間的(de)推(tui)(tui)移增(zeng)加到(dao)1倍以(yi)上，在第(di)(di)15天左右達到(dao)峰(feng)值。

圖3：當細(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)肝(gan)臟(zang)MPS中培(pei)(pei)養(yang)時，肝(gan)功(gong)(gong)(gong)能(neng)持續的(de)(de)(de)時間(jian)(jian)更長(chang)，且(qie)更穩定(ding)，而不是作(zuo)為球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)或(huo)三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)。PHHs在(zai)肝(gan)臟(zang)MPS、球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)和(he)三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)中培(pei)(pei)養(yang)，這些(xie)平(ping)(ping)臺(tai)的(de)(de)(de)功(gong)(gong)(gong)能(neng)被分(fen)析。(a, b) 在(zai)離散的(de)(de)(de)時間(jian)(jian)點為每個培(pei)(pei)養(yang)平(ping)(ping)臺(tai)測量了平(ping)(ping)均CYP3A4活(huo)(huo)性，并且(qie) (a) 歸一化到(dao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)材料的(de)(de)(de)總(zong)蛋白(bai)質(zhi)或(huo) (b) 歸一化到(dao)每個平(ping)(ping)臺(tai)使用的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)數量。(c, d) 在(zai)不同的(de)(de)(de)時間(jian)(jian)點進行(xing)白(bai)蛋白(bai)產(chan)生，并且(qie) (c) 除以(yi)從平(ping)(ping)臺(tai)裂解的(de)(de)(de)總(zong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)蛋白(bai)質(zhi)和(he)介質(zhi)更換(huan)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)天(tian)(tian)數或(huo) (d) 除以(yi)使用的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)數量和(he)介質(zhi)更換(huan)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)天(tian)(tian)數。分(fen)析了肝(gan)臟(zang)MPS的(de)(de)(de)三(san)(san)個孔，三(san)(san)個球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)和(he)六個帶有(you)三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)孔。誤(wu)差線對應于(yu)(yu)(yu)SEM，如果短于(yu)(yu)(yu)符號的(de)(de)(de)大小則(ze)不呈(cheng)現(xian)。進行(xing)了單(dan)因素ANOVA以(yi)評估(gu)最. 多(duo)10天(tian)(tian)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)均值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)方差。對于(yu)(yu)(yu)CYP3A4活(huo)(huo)性 (b)，肝(gan)臟(zang)MPS的(de)(de)(de)ANOVA p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為0.022，球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)的(de)(de)(de)p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為< 0.0001，三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為< 0.0001。對于(yu)(yu)(yu)白(bai)蛋白(bai)產(chan)生 (d)，肝(gan)臟(zang)MPS的(de)(de)(de)p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為0.1，球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)的(de)(de)(de)p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為0.002，三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)的(de)(de)(de)p值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為< 0.0001。相(xiang)(xiang)對于(yu)(yu)(yu)肝(gan)臟(zang)MPS中的(de)(de)(de)功(gong)(gong)(gong)能(neng)變化，從非(fei)參(can)數Spearman相(xiang)(xiang)關測試計算的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關參(can)數r在(zai) (b) 和(he) (d) 中為球(qiu)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)（rspheroids）和(he)三(san)(san)明(ming)(ming)治(zhi)培(pei)(pei)養(yang)（rsandwich cultures）的(de)(de)(de)功(gong)(gong)(gong)能(neng)變化呈(cheng)現(xian)。ANOVA，方差分(fen)析；MPS，微生理系統；PHHs，原代人肝(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。

4、II相(xiang)藥物代(dai)謝(xie)產物的量化和藥物細胞內積累

表征(zheng)人類(lei)特異(yi)性藥物(wu)代(dai)謝(xie)(xie)和(he)細胞(bao)內積累是肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)MPS在(zai)(zai)藥理學中最. 相關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)應用之一。考(kao)慮到(dao)(dao)troglitazone可以產生(sheng)第二階(jie)(jie)段(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)，我們使用這種(zhong)化(hua)合物(wu)來(lai)探索肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)MPS在(zai)(zai)檢(jian)(jian)測(ce)和(he)定量第二階(jie)(jie)段(duan)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)以及第一階(jie)(jie)段(duan)代(dai)謝(xie)(xie)的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)用性。將troglitazone應用到(dao)(dao)肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)MPS后(hou)(hou)，對于測(ce)試的(de)(de)(de)(de)(de)兩種(zhong)濃(nong)度(du)(du)，troglitazone在(zai)(zai)48小(xiao)時的(de)(de)(de)(de)(de)孵(fu)化(hua)后(hou)(hou)幾乎(hu)完全被代(dai)謝(xie)(xie)（圖4a）。如(ru)預(yu)期的(de)(de)(de)(de)(de)對生(sheng)理相關(guan)代(dai)謝(xie)(xie)的(de)(de)(de)(de)(de)建模，troglitazone的(de)(de)(de)(de)(de)第二階(jie)(jie)段(duan)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)（葡萄糖(tang)醛酸(suan)(suan)化(hua)和(he)硫酸(suan)(suan)化(hua)）在(zai)(zai)細胞(bao)培養(yang)基中被定量，其中在(zai)(zai)50μM的(de)(de)(de)(de)(de)troglitazone中檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)量比在(zai)(zai)100μM的(de)(de)(de)(de)(de)troglitazone中更高(gao)，可能是由于在(zai)(zai)最. 高(gao)濃(nong)度(du)(du)時對代(dai)謝(xie)(xie)途徑的(de)(de)(de)(de)(de)毒性效應。接(jie)下(xia)來(lai)，通過分析來(lai)自(zi)肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)MPS的(de)(de)(de)(de)(de)培養(yang)基樣本，對diclofenac的(de)(de)(de)(de)(de)代(dai)謝(xie)(xie)進(jin)行了定量，并且其濃(nong)度(du)(du)觀(guan)察到(dao)(dao)隨時間減少(shao)，顯示出它被代(dai)謝(xie)(xie)。然而，經葡萄糖(tang)醛酸(suan)(suan)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)diclofenac在(zai)(zai)37°C的(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)液中在(zai)(zai)孵(fu)化(hua)2小(xiao)時內變得不穩定，因(yin)此(ci)(ci)在(zai)(zai)48小(xiao)時后(hou)(hou)沒有在(zai)(zai)MPS培養(yang)基中檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)(dao)，就像在(zai)(zai)troglitazone中檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)那樣。因(yin)此(ci)(ci)，如(ru)果(guo)在(zai)(zai)細胞(bao)培養(yang)基中穩定，可以檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)(dao)在(zai)(zai)肝(gan)(gan)臟(zang)(zang)MPS中的(de)(de)(de)(de)(de)PHHs產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)第二階(jie)(jie)段(duan)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)（支持材(cai)料）。

為了評估(gu)肝(gan)臟(zang)(zang)MPS在定(ding)量(liang)(liang)相(xiang)對(dui)于(yu)細(xi)胞外(wai)(wai)環境的(de)(de)細(xi)胞內化(hua)合(he)物(wu)(wu)積累(lei)的(de)(de)潛力，我(wo)們(men)將(jiang)在MPS中(zhong)培養(yang)(yang)的(de)(de)PHHs暴露(lu)于(yu)氯喹chloroquine（圖4b,c），因為已知它在體內積累(lei)在肝(gan)臟(zang)(zang)中(zhong)。處理后(hou)，chloroquine在細(xi)胞裂解物(wu)(wu)中(zhong)被檢(jian)測(ce)到(dao)(dao)，其(qi)量(liang)(liang)是細(xi)胞外(wai)(wai)培養(yang)(yang)基的(de)(de)五倍。為了確保這(zhe)些(xie)結果不受化(hua)合(he)物(wu)(wu)吸附到(dao)(dao)MPS材料的(de)(de)影響，lidocaine、phenacetin、propranolol、prednisolone、diclofenac和(he)ibuprofen的(de)(de)濃(nong)度在肝(gan)臟(zang)(zang)MPS中(zhong)48小時循(xun)環前(qian)后(hou)的(de)(de)培養(yang)(yang)基中(zhong)測(ce)量(liang)(liang)。如支持(chi)材料圖S12所示，當在肝(gan)臟(zang)(zang)MPS中(zhong)循(xun)環前(qian)后(hou)測(ce)量(liang)(liang)時，這(zhe)些(xie)化(hua)合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)濃(nong)度沒有觀察到(dao)(dao)顯. 著的(de)(de)變化(hua)。這(zhe)些(xie)數據表明，在模擬細(xi)胞內藥物(wu)(wu)積累(lei)時，化(hua)合(he)物(wu)(wu)和(he)微流體材料之間的(de)(de)非(fei)特異(yi)性相(xiang)互作用的(de)(de)參與最. 小。然(ran)而(er)，具(ju)有不同物(wu)(wu)理化(hua)學性質的(de)(de)其(qi)他(ta)化(hua)合(he)物(wu)(wu)可能(neng)會結合(he)到(dao)(dao)設備上，因此(ci)可能(neng)需要(yao)在測(ce)試前(qian)進(jin)行(xing)類似的(de)(de)評估(gu)。

圖4：肝(gan)(gan)臟(zang)MPS在(zai)藥物代(dai)謝(xie)(xie)和藥代(dai)動力(li)學研究中的(de)(de)(de)應用。(a) 檢測(ce)troglitazone的(de)(de)(de)第二階段代(dai)謝(xie)(xie)物：troglitazone葡萄糖醛(quan)酸酯和troglitazone硫(liu)酸酯。含有(you)50或100μM troglitazone的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)基被(bei)加(jia)入到每(mei)個濃(nong)度的(de)(de)(de)肝(gan)(gan)臟(zang)MPS的(de)(de)(de)3個孔中，并(bing)維(wei)持2天(tian)(tian)以(yi)進行代(dai)謝(xie)(xie)。在(zai)加(jia)入肝(gan)(gan)臟(zang)MPS之前和之后，通(tong)(tong)過(guo)液相色譜(pu)(pu)-質譜(pu)(pu)法檢測(ce)了(le)培(pei)養(yang)基中的(de)(de)(de)troglitazone和代(dai)謝(xie)(xie)物。*p < 0.03，通(tong)(tong)過(guo)非配對(dui)(dui)的(de)(de)(de)Mann-Whitney非參數測(ce)試(shi)。誤(wu)差線對(dui)(dui)應于(yu)SD。(b) 除(chu)了(le)分析(xi)肝(gan)(gan)臟(zang)MPS中的(de)(de)(de)上清培(pei)養(yang)基外，還將支架內的(de)(de)(de)細胞裂解(jie)以(yi)評估藥物的(de)(de)(de)組織內積累。(c) 含有(you)31.5μM chloroquine的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)基被(bei)加(jia)入到肝(gan)(gan)臟(zang)MPS的(de)(de)(de)2個孔中，并(bing)孵化2天(tian)(tian)，以(yi)在(zai)消化含有(you)細胞的(de)(de)(de)支架后通(tong)(tong)過(guo)液相色譜(pu)(pu)-質譜(pu)(pu)法測(ce)量(liang)其組織內積累。對(dui)(dui)于(yu)兩個樣(yang)本(ben)，相對(dui)(dui)于(yu)上清樣(yang)本(ben)，在(zai)組織裂解(jie)物中觀察到chloroquine的(de)(de)(de)濃(nong)度高出10倍。MPS，微(wei)生理系統。

5、通過測量CYP3A4活性和LDH產生(sheng)對單個MPS孔進行質量控制(zhi)

為了驗(yan)(yan)證(zheng)使(shi)用(yong)(yong)非破壞性(xing)和(he)微創檢測(ce)(ce)(ce)(ce)作為MPS復(fu)制(zhi)的(de)(de)(de)可靠質量(liang)(liang)控制(zhi)指標，我們測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)(liang)了灌(guan)流(liu)物中的(de)(de)(de)CYP3A4活(huo)性(xing)和(he)LDH產生(sheng)（圖(tu)5a,b），并結合(he)支(zhi)(zhi)架成(cheng)像(xiang)(xiang)（實驗(yan)(yan)后(hou)）和(he)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)分析（成(cheng)像(xiang)(xiang)后(hou)：圖(tu)5c）。這(zhe)(zhe)些參數(shu)在(zai)單(dan)個(ge)(ge)肝臟(zang)MPS板(ban)中的(de)(de)(de)單(dan)個(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)進行(xing)了研究（圖(tu)5），其中成(cheng)像(xiang)(xiang)和(he)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)分析被(bei)用(yong)(yong)作質量(liang)(liang)控制(zhi)參數(shu)的(de)(de)(de)確(que)認(ren)測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)(liang)。對(dui)(dui)一個(ge)(ge)肝臟(zang)MPS板(ban)（12個(ge)(ge)孔(kong)(kong)(kong)）的(de)(de)(de)分析顯(xian)示，特定孔(kong)(kong)(kong)（B6）的(de)(de)(de)LDH產生(sheng)顯(xian). 著(zhu)大于其他(ta)孔(kong)(kong)(kong)（圖(tu)5a）。根據(ju)這(zhe)(zhe)個(ge)(ge)結果(guo)，B6孔(kong)(kong)(kong)的(de)(de)(de)支(zhi)(zhi)架圖(tu)像(xiang)(xiang)顯(xian)示出比(bi)其他(ta)孔(kong)(kong)(kong)低的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)計(ji)(ji)數(shu)（圖(tu)5c），從(cong)而確(que)認(ren)了基(ji)于這(zhe)(zhe)個(ge)(ge)標準的(de)(de)(de)不適(shi)用(yong)(yong)性(xing)。盡管在(zai)測(ce)(ce)(ce)(ce)定CYP3A4活(huo)性(xing)（圖(tu)5b）時觀察(cha)到(dao)了較高程度的(de)(de)(de)孔(kong)(kong)(kong)間變異性(xing)，但這(zhe)(zhe)個(ge)(ge)測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)(liang)似乎與異常的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)密度相(xiang)吻合(he)，如支(zhi)(zhi)架A3所(suo)示，它表(biao)現出低的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)密度以及(ji)非均勻的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)分布(bu)。然而，在(zai)某些情(qing)況下(xia)，CYP3A4活(huo)性(xing)和(he)微組織的(de)(de)(de)視覺(jue)特征之間的(de)(de)(de)關系并不明顯(xian)，如支(zhi)(zhi)架A6和(he)B5所(suo)示，它們在(zai)視覺(jue)上(shang)類似于支(zhi)(zhi)架B4（圖(tu)5c）。對(dui)(dui)于每(mei)個(ge)(ge)用(yong)(yong)于實驗(yan)(yan)的(de)(de)(de)板(ban)，我們取消了與高LDH產生(sheng)值相(xiang)關的(de)(de)(de)孔(kong)(kong)(kong)收集(ji)的(de)(de)(de)數(shu)據(ju)，這(zhe)(zhe)些值是統計(ji)(ji)離(li)群值或CYP3A4活(huo)性(xing)低于最(zui). 大測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)(liang)值的(de)(de)(de)50%。孔(kong)(kong)(kong)A3和(he)B6顯(xian)然符合(he)這(zhe)(zhe)些排除標準，如果(guo)孔(kong)(kong)(kong)A6和(he)B5被(bei)識別為統計(ji)(ji)離(li)群值，將(jiang)被(bei)標記以供以后(hou)考(kao)慮(lv)。

為(wei)了進一步測(ce)試(shi)這(zhe)些標(biao)準是否能(neng)(neng)有(you)效(xiao)地區分(fen)功能(neng)(neng)孔(kong)(kong)(kong)(kong)和缺陷孔(kong)(kong)(kong)(kong)，我們分(fen)析(xi)了使(shi)用(yong)(yong)特(te)定(ding)(ding)途(tu)徑的(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)(ju)(ju)合(he)酶鏈反應陣列篩選的(de)(de)(de)(de)(de)84個基(ji)(ji)因在(zai)孔(kong)(kong)(kong)(kong)間的(de)(de)(de)(de)(de)變異性(xing)，該陣列用(yong)(yong)于(yu)檢測(ce)人類藥物代謝。B6孔(kong)(kong)(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)(zong)RNA產量低于(yu)建(jian)議(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)400 ng輸入水(shui)平(ping)，因此被(bei)排(pai)除(chu)在(zai)分(fen)析(xi)之(zhi)外。根據藥物代謝面板中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)84個基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表達，對(dui)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)樣本進行(xing)(xing)了層次聚(ju)(ju)(ju)類（圖5d）。對(dui)基(ji)(ji)因表達分(fen)析(xi)數(shu)據進行(xing)(xing)了主成分(fen)分(fen)析(xi)，以(yi)更好地評估孔(kong)(kong)(kong)(kong)聚(ju)(ju)(ju)類（圖5e）。總(zong)(zong)的(de)(de)(de)(de)(de)來(lai)(lai)說(shuo)，孔(kong)(kong)(kong)(kong)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因表達沒有(you)觀(guan)察(cha)到主要差(cha)異，然而，孔(kong)(kong)(kong)(kong)A3和B2與其他(ta)孔(kong)(kong)(kong)(kong)分(fen)開(kai)聚(ju)(ju)(ju)類。孔(kong)(kong)(kong)(kong)B2與其他(ta)孔(kong)(kong)(kong)(kong)聚(ju)(ju)(ju)類更接近，而不是A3。基(ji)(ji)于(yu)樣本的(de)(de)(de)(de)(de)無偏(pian)聚(ju)(ju)(ju)類分(fen)析(xi)（圖5d，圖S13），在(zai)由孔(kong)(kong)(kong)(kong)A1、A2、A4、A5、B1、B3、B4和B5組(zu)成的(de)(de)(de)(de)(de)對(dui)照組(zu)中(zhong)，孔(kong)(kong)(kong)(kong)A3、A6和B2被(bei)分(fen)類為(wei)離(li)群值。相(xiang)對(dui)于(yu)對(dui)照組(zu)，離(li)群組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因表達的(de)(de)(de)(de)(de)倍(bei)數(shu)變化在(zai)圖S14中(zhong)呈(cheng)現，而在(zai)組(zu)之(zhi)間變化顯. 著的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因列在(zai)表S2中(zhong)。在(zai)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)84個基(ji)(ji)因中(zhong)，有(you)8個在(zai)離(li)群組(zu)中(zhong)上(shang)調，11個相(xiang)對(dui)于(yu)對(dui)照組(zu)下調。總(zong)(zong)的(de)(de)(de)(de)(de)來(lai)(lai)說(shuo)，這(zhe)些結果支(zhi)持使(shi)用(yong)(yong)LDH產生和CYP3A4活(huo)性(xing)作為(wei)進行(xing)(xing)肝臟(zang)MPS實驗(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)靠、非(fei)侵入性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)量控制指標(biao)。此外，從灌流物中(zhong)定(ding)(ding)量的(de)(de)(de)(de)(de)其他(ta)肝生物標(biao)志(zhi)物或代謝測(ce)定(ding)(ding)也可(ke)(ke)能(neng)(neng)是同樣有(you)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)量控制指標(biao)，這(zhe)可(ke)(ke)能(neng)(neng)取(qu)決于(yu)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)上(shang)下文。

圖(tu)(tu)(tu)(tu)5：評(ping)估LDH產(chan)(chan)生和(he)CYP3A4活性(xing)(xing)作為單個(ge)孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質量(liang)控制措施(shi)。在播(bo)種細(xi)胞后的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)運行第4天更換細(xi)胞培養基(ji)之前，從(cong)每(mei)個(ge)孔收集(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)培養基(ji)中(zhong)測(ce)定了(le)LDH（a），并測(ce)量(liang)了(le)CYP3A4活性(xing)(xing)（b），以評(ping)估肝臟(zang)(zang)MPS板(ban)(ban)(ban)孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞功能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質量(liang)。誤差線代(dai)表(biao)(biao)三個(ge)測(ce)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術重復的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)SD。*0.05 < p < 0.02 和(he) **0.02 < p < 0.002 和(he) ***p < 0.002 由未(wei)配對的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)t檢驗(yan)與(yu)Welch's校正。在呈現(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數據集(ji)上方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)*，**和(he)***表(biao)(biao)示相對于(yu)B1孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)均值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)LDH或CYP3A4產(chan)(chan)生的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)統(tong)計學顯. 著(zhu)性(xing)(xing)。除非(fei)另有(you)指示，否則呈現(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)均值(zhi)(zhi)(zhi)與(yu)從(cong)B1孔獲得(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)均值(zhi)(zhi)(zhi)在統(tong)計學上沒有(you)差異。(c) 每(mei)個(ge)對應于(yu)肝臟(zang)(zang)MPS孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)支架在從(cong)板(ban)(ban)(ban)中(zhong)移除后用明場顯微鏡成像。刻度條代(dai)表(biao)(biao)1毫米的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長度。對于(yu)基(ji)因(yin)(yin)表(biao)(biao)達分(fen)析(xi)（d，e），使用Qiagen的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RT2 Profiler PCR Array進行人類(lei)(lei)藥(yao)物代(dai)謝評(ping)估，涉及84個(ge)參(can)與(yu)藥(yao)物代(dai)謝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)。由于(yu)樣(yang)本B6的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)量(liang)低于(yu)測(ce)定所需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)量(liang)，因(yin)(yin)此(ci)從(cong)基(ji)因(yin)(yin)表(biao)(biao)達分(fen)析(xi)中(zhong)排除。面(mian)板(ban)(ban)(ban)陣列(lie)上五(wu)個(ge)最. 小變(bian)異目標的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)均值(zhi)(zhi)(zhi)被用作歸(gui)一(yi)化Ct值(zhi)(zhi)(zhi)（ΔCt）計算的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)母(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內源性(xing)(xing)控制值(zhi)(zhi)(zhi)。(d) 基(ji)因(yin)(yin)表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)層次聚類(lei)(lei)圖(tu)(tu)(tu)(tu)。熱圖(tu)(tu)(tu)(tu)代(dai)表(biao)(biao)一(yi)組基(ji)因(yin)(yin)（行）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ΔCt，用于(yu)每(mei)個(ge)隔離的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)支架（列(lie)）。歐幾里得(de)距離和(he)平(ping)均鏈接被用作聚類(lei)(lei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)參(can)數。(e) 來自軟(ruan)件CLC Genomics Workbench（Qiagen）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)成分(fen)圖(tu)(tu)(tu)(tu)，描繪了(le)樣(yang)本在由協方差矩陣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)第一(yi)和(he)第二(er)主(zhu)成分(fen)跨越的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)維空間(jian)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)投(tou)影。主(zhu)圖(tu)(tu)(tu)(tu)內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)箱(xiang)線圖(tu)(tu)(tu)(tu)呈現(xian)了(le)ΔCt值(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)布。LDH，乳酸脫氫酶；MPS，微生理系(xi)統(tong)；n.s.表(biao)(biao)示不顯. 著(zhu)。

結論

肝臟MPS的(de)可重復(fu)性(xing)是根據其預(yu)測肝毒性(xing)、估計藥物代(dai)謝和積累(lei)以及研(yan)究需要細胞(bao)長期功能的(de)藥物效(xiao)應(ying)的(de)潛力(li)進行表征(zheng)的(de)。基于(yu)細胞(bao)的(de)藥物開(kai)發(fa)方(fang)法必須健壯、產生可重復(fu)的(de)結果、具(ju)有明(ming)確定義的(de)質(zhi)量控制(zhi)(zhi)標準、并依賴于(yu)可以輕(qing)松獲(huo)取或制(zhi)(zhi)造的(de)材料(liao)。在當前的(de)研(yan)究中，我們遵循了這一指(zhi)南，使用了商業上(shang)可獲(huo)得(de)的(de)細胞(bao)、設備、儀器和供應(ying)品(pin)。

運用MPS面臨(lin)的(de)一個挑戰(zhan)是將MPS從學術團(tuan)體(ti)轉(zhuan)移到(dao)藥物(wu)開發(fa)實驗室(shi)，這些(xie)(xie)團(tuan)體(ti)通常具有在微(wei)細(xi)(xi)加工(gong)和儀器方法(fa)方面的(de)獨(du)特(te)專業(ye)知識，或者對細(xi)(xi)胞類型的(de)半du jia訪(fang)問(wen)權。除了來自(zi)行業(ye)的(de)努力(li)，我(wo)(wo)們(men)還(huan)創建了測試中(zhong)心來解決這些(xie)(xie)轉(zhuan)化(hua)障礙，初步結果(guo)顯示了不同藥物(wu)開發(fa)利益相(xiang)關者生成(cheng)關于MPS使用的(de)關鍵表征數(shu)據的(de)需求。我(wo)(wo)們(men)的(de)數(shu)據證(zheng)明，盡管肝臟MPS能夠分析(xi)藥物(wu)代謝，但應該(gai)仔(zi)細(xi)(xi)注意代謝物(wu)的(de)穩定性和樣本(ben)收集的(de)時間。

我們(men)(men)在MPS中培養的(de)PHHs內檢測(ce)到的(de)chloroquine與(yu)體內結(jie)果一致，并證明了(le)MPS用于藥物(wu)分(fen)布研究的(de)潛力。細胞運輸在調節(jie)積累(lei)中起著(zhu)核心作用，MPS研究已(yi)經通過藥物(wu)清除、基因表達和(he)(he)成(cheng)像測(ce)定報告了(le)強大的(de)運輸活(huo)性。與(yu)已(yi)發(fa)表的(de)結(jie)果一致，我們(men)(men)的(de)數據證實了(le)MPS預測(ce)藥物(wu)代(dai)謝和(he)(he)藥代(dai)動力學(xue)的(de)潛力，應該用肝臟MPS探索藥物(wu)開(kai)(kai)發(fa)的(de)其他應用，因為已(yi)經開(kai)(kai)發(fa)了(le)多(duo)種類型(xing)的(de)肝系(xi)統，未來的(de)工(gong)作應該比(bi)較它(ta)們(men)(men)以(yi)評估每個模型(xing)的(de)優點(dian)和(he)(he)缺點(dian)。

總體而言(yan)，這項研究的結(jie)果與已發表(biao)的數(shu)據一致，表(biao)明肝臟MPS可以重(zhong)現結(jie)果。使用質(zhi)量控制標(biao)準(zhun)產生功能性(xing)微組織是實現可重(zhong)復性(xing)的關(guan)鍵。此外(wai)，肝臟MPS相對(dui)于其他PHH培(pei)養平臺穩(wen)定(ding)了肝功能。除了這項研究，未(wei)來的工作(zuo)應該評估肝臟MPS作(zuo)為藥物開發工具在特定(ding)使用環境中的價值(zhi)。