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誘導性多能干細胞 (iPSC) 分化為神經外胚層

iPSC向三胚(pei)層(ceng)(ceng)分(fen)化(hua)系列,將分(fen)別介紹誘導(dao)多能干細(xi)胞（iPSCs）分(fen)化(hua)為(wei)外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)、中胚(pei)層(ceng)(ceng)和內胚(pei)層(ceng)(ceng)譜(pu)系過程的Protocol，本期將重點討論將 iPSC 分(fen)化(hua)為(wei)神經外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)細(xi)胞的Protocol。

無飼養層人類誘導多能干細胞 (iPSC) 分化為神經外胚層細胞是一個復雜的過程，需要使用 noggin 和 FGF2 等生長因子。此外，還需要使用激活素受體樣激酶受體阻斷劑 SB431542 等因子來提高分化效率并穩定神經外胚層命運。這種組合使研究人員能夠可靠地生成功能性神經外胚層細胞用于各種生物醫學應用。在本應用說明中，我們概述了使用含有QKine的重組 FGF2 家族成員（如 Qkine FGF2-G3 (Qk053)）和 noggin(Qk034）的(de)培養基將iPSC分化(hua)(hua)為神(shen)經(jing)外胚(pei)層(ceng)細胞的(de)方(fang)法(fa)。神(shen)經(jing)外胚(pei)層(ceng)標志物表達用于通過免疫細胞化(hua)(hua)學評估成功分化(hua)(hua)。

01   介紹

iPSCs是一種(zhong)體外(wai)(wai)模型(xing)，代表了(le)再(zai)生(sheng)醫(yi)學和細胞(bao)生(sheng)物學領域的重大突破。通過重編程，iPSCs具備了(le)分化(hua)為三胚(pei)層（外(wai)(wai)胚(pei)層、中(zhong)胚(pei)層和內(nei)胚(pei)層）中(zhong)任(ren)意(yi)細胞(bao)類型(xing)的能力。這為疾病建(jian)模、藥(yao)物發現和基于細胞(bao)的治療提供了(le)較大潛力，并且不涉及使用胚(pei)胎(tai)干細胞(bao)的倫理問(wen)題[1]。

鑒(jian)于(yu)外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)在(zai)生成中樞和周(zhou)圍神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)(tong)(tong)、感覺器官和皮膚方面的作用，將(jiang)iPSC分化為外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)譜系(xi)(xi)尤為重要[2]。將(jiang)iPSC分化為神(shen)(shen)經(jing)(jing)外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)細胞，然后進一步分化為外(wai)胚(pei)層(ceng)(ceng)譜系(xi)(xi)，對于(yu)研究神(shen)(shen)經(jing)(jing)發育過程、模擬神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)(tong)(tong)疾病(bing)以及(ji)開發影響神(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)(tong)(tong)和皮膚的疾病(bing)的潛在(zai)療法十分重要。

iPSC分化為神(shen)(shen)經(jing)外胚層細胞通常涉及在體(ti)外模(mo)擬(ni)胚胎(tai)發(fa)育(yu)階(jie)段(duan)。在早期胚胎(tai)發(fa)生過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)，神(shen)(shen)經(jing)外胚層的形(xing)(xing)成(cheng)是通過(guo)抑(yi)制(zhi)幾種信(xin)號通路來啟動(dong)的，例如使用(yong)SB431542等(deng)小分子抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)抑(yi)制(zhi)TGF-β通路，以及使用(yong)noggin等(deng)BMP抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)抑(yi)制(zhi)骨形(xing)(xing)態發(fa)生蛋白(BMP)通路，這模(mo)擬(ni)了神(shen)(shen)經(jing)板形(xing)(xing)成(cheng)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)發(fa)生的BMP自然抑(yi)制(zhi)[3]。

iPSC成功分(fen)化為神經(jing)外胚層細胞并(bing)非沒(mei)有(you)挑戰。由于iPSC系內存在差(cha)異，分(fen)化效率以及不完全或(huo)混合(he)譜系分(fen)化的可(ke)能(neng)性(xing)是(shi)研究(jiu)人員繼續解決的重大(da)障礙。可(ke)以通(tong)過研究(jiu)SRY-box轉錄因子1(SOX1)和SRY-box轉錄因子2(SOX2)等標記(ji)物的表達來(lai)評(ping)估成功率[4]。

02   材料(liao)和(he)方法

1.細胞(bao)培養和(he)維(wei)護

每(mei)周(zhou)(zhou)使用(yong) 0.5 mM EDTA 傳代兩次 iPSC 以(yi)分離，然后以(yi) 1:6 的(de)分流比接種在(zai)玻璃(li)粘(zhan)連蛋白vitronectin ( Qkine，Qk120 ) (5 μg/ml) 包被的(de) 6 孔板中，并在(zai) E8 類(lei)培養(yang)(yang)基(ji)中培養(yang)(yang)。傳代后的(de)第二天(tian)，去除用(yong)過的(de)培養(yang)(yang)基(ji)，用(yong) 5 ml E8 類(lei)培養(yang)(yang)基(ji)替換，使細胞遵(zun)循周(zhou)(zhou)末無(wu)培養(yang)(yang)基(ji)更(geng)換模式。有關此(ci)過程的(de)更(geng)多(duo)信息，使用(yong)Qkine的(de)耐熱 FGF-2 (bFGF)以(yi)及我們的(de)無(wu)動物來源TGF-β1和玻璃(li)粘(zhan)連蛋白進(jin)行周(zhou)(zhou)末無(wu)人類(lei)誘導多(duo)能(neng)干細胞培養(yang)(yang)，以(yi)提高菌(jun)落同質性(xing)。

2.iPSC 分化為(wei)神經外胚層

神經(jing)外(wai)胚層分化工作流程示(shi)意圖（圖 1）概述(shu)了 iPSC 分化為神經(jing)外(wai)胚層的(de)步(bu)驟(zou)以及(ji)通過測試神經(jing)外(wai)胚層表(biao)達標記來評估分化的(de)步(bu)驟(zou)。

圖1.神經(jing)外胚層(ceng)分化和(he)評估(gu)測試(shi)時間表

使用(yong)(yong)Accutase分(fen)離iPSC ，并(bing)以1,000個細胞/孔的(de)密度接種在涂有vitronectin (Qk120) (5 μg/ml) 的(de) 96 孔板(ban)中(zhong)，該板(ban)中(zhong)的(de) E8 類培(pei)養(yang)基含有 ROCK 抑制劑 (Y-27632, 10 μM)。第二天 (第1天) 以及(ji)直到(dao)第 10 天的(de)每一天，細胞都用(yong)(yong)外胚(pei)層培(pei)養(yang)基喂養(yang) (表1)。

表1.日常神經外(wai)胚層培養基配(pei)制成分(fen)，各成分(fen)在使用前無(wu)菌添加

表2.CDM-PVA培養(yang)基(ji)配制(zhi)成(cheng)分(fen)，各成(cheng)分(fen)無菌(jun)添加(jia)，并在使用前過濾培養(yang)基(ji)

3.免疫細胞化(hua)學

在第10天，細胞用4%多聚(ju)甲醛固定(ding)，并用10%驢血清（稀釋在0.1% Triton X-100中）進(jin)行封(feng)閉和透化。

針對外胚層標志物SOX1和SOX2的特(te)異性抗(kang)體被用于免疫染色(se)，并在4°C下孵育(yu)過夜。然后(hou)，將iPSCs洗滌后(hou)與二抗(kang)（Donkey anti-Goat AlexaFluor 488）和Hoechst 33258孵育(yu)，最后(hou)在磷酸(suan)鹽(yan)緩沖液中進行成像。

圖2. 分(fen)化 iPSC 中神經外胚層標志物的(de)免疫(yi)細胞化學。SRY -box 轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因子 1 (SOX1) [綠(lv)色(se)，A]、Hoechst 33258 [藍(lan)(lan)色(se)，B]、SOX1 和 Hoechst 的(de)組(zu)合 [C] 和 SRY-box 轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因子 2 (SOX2) [綠(lv)色(se)，D]、Hoechst33258 [藍(lan)(lan)色(se)，E]、SOX2 和 Hoechst 的(de)組(zu)合 [F]。圖像是(shi)使(shi)用(yong) EVOS M5000 系統獲取(qu)的(de)（比例尺 = 300 μm）。

03   結論

由于 iPSC 具(ju)有分(fen)化成人體所有體細胞(bao)類型的潛(qian)力，其在(zai)臨床和研究領域的重(zhong)要性(xing)日(ri)益(yi)增加。iPSC 成功分(fen)化為(wei)所需細胞(bao)類型（如神經外(wai)胚層細胞(bao)）依賴于在(zai)培養過程中保持 iPSC 的多能性(xing)以及同(tong)質分(fen)化。因此，使用含有高純度生物活性(xing)生長因子(zi)的正確培養基對(dui)于實現此目的的可重(zhong)復性(xing)十分(fen)重(zhong)要。

本應用(yong)說明中(zhong)提供的數據表(biao)明，使用(yong) Qkine FGF2-G3（Qk053）和(he) Qkine noggin (Qk034).支持 iPSC 分化為神(shen)經外胚層(ceng)。

參考文獻

[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914

[2] Tchieu, J. et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 2017 Sep 7;21(3):399-410.e7. doi: 10.1016/j.stem.2017.08.015

[3] Smith, J. R. et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 2008 Jan 1;313(1):107-17. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.10.003

[4] Galiakberova, A. A. et al. Neural Stem Cells and Methods for Their Generation From Induced Pluripotent Stem Cells in vitro. Frontiers in cell and developmental biology. 2020 Oct 8:8:815. doi: 10.3389/fcell.2020.00815

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