無(wu)動物來(lai)源(yuan)的BDNF和GDNF神經(jing)生(sheng)長因子可增(zeng)強iPSC衍生(sheng)的神經(jing)元(yuan)培養

本項(xiang)合作(zuo)(zuo)研究的數據為(wei)Qkine與德(de)國神(shen)經退行(xing)性(xing)疾(ji)病中心Rodriguez-Muela實驗室合作(zuo)(zuo)發表。

01   引言

神經(jing)退(tui)行(xing)(xing)性(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)涉及神經(jing)元的(de)(de)(de)退(tui)化(hua)，包(bao)括一系(xi)列疾(ji)(ji)病(bing)，包(bao)括與年(nian)齡相關(guan)的(de)(de)(de)認知障礙(ai)（阿爾(er)茨海默病(bing)和(he)帕金(jin)森病(bing)）、肌萎縮(suo)(suo)側(ce)索(suo)硬化(hua)癥(zheng) (ALS) 和(he)脊髓性(xing)(xing)肌萎縮(suo)(suo)癥(zheng) (SMA)。目前，尚無(wu)明確的(de)(de)(de)治療方(fang)法，神經(jing)組織的(de)(de)(de)復雜性(xing)(xing)和(he)合適(shi)模型系(xi)統有(you)限的(de)(de)(de)可(ke)用性(xing)(xing)給神經(jing)退(tui)行(xing)(xing)性(xing)(xing)疾(ji)(ji)病(bing)的(de)(de)(de)研究(jiu)帶來(lai)了挑戰。

人類(lei)誘(you)導(dao)多能干細胞(bao) (iPSC) 的進(jin)展(zhan)為(wei)研究(jiu)神經(jing)發育、疾病機(ji)制和藥(yao)物治療提供了新的有價值(zhi)的體外模型(xing)系統來源。通(tong)過特(te)定地接觸小分子(zi)(zi)，包括生長(chang)因(yin)子(zi)(zi)和細胞(bao)因(yin)子(zi)(zi)，iPSC可(ke)以被引導(dao)分化為(wei)神經(jing)干細胞(bao)，隨后分化為(wei)各種神經(jing)和神經(jing)膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)類(lei)型(xing)。

腦源性神經營養因子 (BDNF，Qk050) 和神經膠質細胞源性神經營養因子 (GDNF，Qk051) 屬于神經營養因子家族

，在(zai)胚胎發(fa)(fa)育和成年期神經系統(tong)維持(chi)(chi)過程中(zhong)發(fa)(fa)揮(hui)關鍵作用 [1]。在(zai)細胞培養(yang)中(zhong)，它(ta)們是iPSC分化為運動神經元 (MN) 以及長(chang)期維持(chi)(chi)培養(yang)神經元獨特特征(zheng)和功能(neng)的重(zhong)要生長(chang)因子 [2 , 3]。因此(ci)，擁有高質量和生物(wu)活性的蛋白(bai)質對于產生可重(zhong)復、可靠和生理相(xiang)關的神經培養(yang)物(wu)至(zhi)關重(zhong)要。

這項(xiang)合作研究比較了Qkine和(he)R供應商的(de)BDNF和(he)GDNF在支(zhi)持iPSC衍生運動神經(jing)元分化和(he)維持方面(mian)的(de)能力(li)。

02   結果（材料與方法請(qing)于文(wen)末查看）

1. 重組BDNF和GDNF蛋白成功將人類iPSC分化為(wei)MN

Qkine和R供(gong)應商的重組BDNF和GDNF蛋白可有效支持終末期分化 EB 的形成。到第15天時，EB呈球形，表面光滑，直徑約為500-550μM（EB15，圖1）。從這些EB中分離出的MN在相同的培養基中培養，并補充了Qkine或R供(gong)應商的重組BDNF和GDNF蛋白。2天后（DIV2），運動神經元顯示出健康的神經元形態，神經突延伸清晰。到第5天（DIV5），神經元的樹枝狀化和一些聚集現象增加，這是衰老iPSC衍生的神經元培養物的典型特征（圖1）。

圖(tu)(tu)1：用BDNF和GDNF培養的(de)胚狀體(ti)和分離(li)的(de)運動(dong)神經元的(de)形態和活力評(ping)估(gu)。明場圖(tu)(tu)像(xiang)代表分化方案第15天(tian) (EB15) 的(de)EB（比(bi)例尺=250 μm）以及體(ti)外2天(tian) (DIV2) 和5天(tian) (DIV5) 后(hou)從相同(tong)EB分離(li)的(de)MN（比(bi)例尺=100 μm）。

2. MN表達MAP2和Islet1

在不同時間點（DIV2和DIV8）使用神經元特異性樹突狀標記物微管相關蛋白2 (MAP2) 和特征性運動神經元標記物Islet1進行免疫細胞化學分析，以確認產生的細胞為 MN（圖2A）。Qkine 和R供應商(shang)的兩種蛋白質均產生高純度的神經元培養物，這由兩個測試時間點的 95% 的細胞為 MAP2+ 證明（圖2B）。對于兩個供應商，在DIV2和DIV8時，40-50%的培養物表現出特征性運動神經元標記物 Islet1，表明MAP2+/Islet1+運動神經元在培養中得到可靠維持（圖2C）。此外，Qkine和R&D都顯示從DIV2到DIV8培養中MAP2+/Islet1+ MN的維持和存活率相似（圖2D）。

圖2：iPSC 衍(yan)生 MN 的(de)特(te)征。免疫細胞(bao)化(hua)學圖像代表在 DIV8 時用 DAPI（灰(hui)色(se)）、MAP2（洋(yang)紅色(se)）和 Islet1（綠(lv)色(se)）染色(se)的(de) iPSC 衍(yan)生運(yun)動(dong)神(shen)經(jing)元（A，比(bi)(bi)(bi)例尺 = 50 μm）。量化(hua) MAP2+ 神(shen)經(jing)元百分比(bi)(bi)(bi)（B）、MAP2+/Islet1+ 細胞(bao)百分比(bi)(bi)(bi)（C）、DIV2 和 DIV8 后 Islet1+ 細胞(bao)數量倍數變(bian)化(hua)（D）。

03   討論

Qkine和R供(gong)應商的重組人BDNF和GDNF蛋白在2D和3D培養系統中有效生成并維持了健康的iPSC衍生MN。使用兩家供應商的生長因子生成的MN從DIV2到DIV8以類似的方式表達標記MAP2和Islet1。Qkine BDNF和GDNF是可靠的無動物來源 (AOF) 蛋白，可用于神經培養物的分化及其后續維持。AOF蛋白減少了動物來源材料的變異性，并確保了MN分化中更可控的環境和可重復性。

隨著iPSC衍(yan)生(sheng)的神經元(yuan)模(mo)型（包括人類iPSC衍(yan)生(sheng)的 MN）的使用越(yue)(yue)來越(yue)(yue)多，以更實惠的規模(mo)生(sheng)產這些神經元(yuan)的能力(li)變得十(shi)分重(zhong)要。AOF蛋白可以滿足培(pei)(pei)養(yang)MN的規模(mo)化挑戰，因(yin)為它們可以批(pi)量生(sheng)產，同時(shi)保(bao)持高純度和生(sheng)物(wu)活性(xing)。此外，將AOF重(zhong)組蛋白整合到運動神經元(yuan)培(pei)(pei)養(yang)物(wu)中可保(bao)障這些培(pei)(pei)養(yang)物(wu)在需要時(shi)可以轉化為下游臨床應(ying)用。

高品質生長(chang)因(yin)(yin)子對于開發和(he)維持(chi)穩(wen)健、可重復且生理(li)相關(guan)的(de)(de)神(shen)經培養(yang)十分(fen)重要(yao)。在(zai)無(wu)動物表達系統中開發的(de)(de)生長(chang)因(yin)(yin)子具有更(geng)高的(de)(de)批次間一(yi)致性，并且病(bing)(bing)毒(du)、朊病(bing)(bing)毒(du)和(he)其(qi)他動物源成分(fen)的(de)(de)污染風險(xian)更(geng)低。Qkine的(de)(de)生長(chang)因(yin)(yin)子和(he)細胞因(yin)(yin)子均通過嚴格的(de)(de)生化(hua)和(he)生物活(huo)性質量控(kong)制測試，用戶可放心使用神(shen)經干(gan)細胞培養(yang)試劑。

04   材料與方法

1. iPSC向MN的分(fen)化

人類iPSC在添加了1% Penstrep（Thermofisher Scientific，15140122）的(de)(de)mTeSR Plus培(pei)養(yang)基（Stem Cell Technologies，100-0276）中(zhong)培(pei)養(yang)。使用1x PBS 中(zhong)的(de)(de)5 mM EDTA 將iPSC傳代到Matrigel（Corning，354234）涂層(ceng)板上。使用成熟的(de)(de)方案生成運動(dong)神(shen)經元(yuan) [4,5]。

球體或胚狀體 (EB) 是(shi)由在添(tian)加了10 μM Y-27632（MedChemExpress，HY-10583）和10 ng/ml FGF-2（Millipore，3216002）的(de)mTeSR Plus中懸(xuan)(xuan)浮的(de)分(fen)離小iPSC聚集體生成(cheng)的(de)。將懸(xuan)(xuan)浮液置于超(chao)低附著10厘米板（Corning,4615）中，在37?C 的(de)恒(heng)溫箱(xiang)中，在定軌振蕩器上培養，并(bing)使用(yong)下面(mian)顯示(shi)的(de)方案分(fen)化所得的(de)EB（圖(tu)3）。

圖(tu)3：iPSC分(fen)化為MN的(de)方案。示意(yi)圖(tu)描述(shu)了iPSC分(fen)化為MN期間使用(yong)的(de)培養基形(xing)成

為了比較Qkine與R供應(ying)商BDNF和GDNF的功效（表1），使用每種化合物組來分化和培養獨立的EB組和所得的 MN。

表1：本研究中使用的重組人BDNF和GDNF蛋白的來源

2. hiPSC衍生MN的接種(zhong)和(he)培(pei)養

分化后，使用(yong)Worthington木瓜蛋白(bai)酶解離系統 (Worthington; 9035-81-1、9048-46-8、9003-989、9001-73-4) 將EB解離為(wei)單個(ge)(ge)細胞。MN以80,000個(ge)(ge)細胞/孔的(de)密度(du)接種(zhong)到黑色平底Greiner μClear 96孔板 (Greiner Bio-One, 655090) 中，涂(tu)有50 μg/ml聚 D-賴氨酸 (Sigma-Aldrich, A-003-E)、1x硼酸鹽緩沖液(ye) (Thermofisher Scientific, 28341) 和2.5 μg/ml層(ceng)粘連蛋白(bai) (Thermofisher Scientific, 23017015)。接種(zhong)后每2-3天(tian)(tian)(tian)更(geng)換一次(ci)培養基。在第2天(tian)(tian)(tian) (DIV2) 和第8天(tian)(tian)(tian) (DIV8)，用(yong)4%無甲醇 PFA (Pierce, 28908) 固定(ding)單個(ge)(ge)MN板 12-15 分鐘(zhong)。固定(ding)后，用(yong)1x Dulbecco's PBS -Ca/-Mg (Thermofisher Scientific; 14190169) 清(qing)洗細胞 3 次(ci)。

3. iPSC衍生MN的免疫細(xi)胞(bao)化學、成像和分析(xi)

在(zai)1x Dulbecco's PBS -Ca/Mg 中(zhong)的0.25% Triton和(he) 1.0%正(zheng)常山羊血清(qing)中(zhong)進行樹突(tu)狀(zhuang)標記物(wu) MAP2 (Novus Biologicals；NB300-213)和(he)MN標記物(wu)Islet1 (Abcam；Ab109517) 的免疫細胞化學分析。所用(yong)的二抗是抗雞 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 (A21449) 和(he)抗兔 IgG (H+L) Alexa Fluor 546 (A11035)。

使(shi)(shi)用Hoechst 33342 (Invitrogen；H3570) 對細胞核進(jin)行染(ran)色。然后(hou)使(shi)(shi)用Perkin Elmer Operetta CLS的40x水物鏡(jing)在非共焦模式下對染(ran)色的MN進(jin)行成像，并使(shi)(shi)用Perkin Elmer的Columbus瀏覽器支持(chi)軟件對圖(tu)像進(jin)行量化(hua)。EB和(he)MN的明場(chang)圖(tu)像分別(bie)使(shi)(shi)用配備4倍和(he)20倍物鏡(jing)的尼康Eclipse Ts2顯微鏡(jing)拍攝。

文獻參考

[1] Skaper, S. D. The Neurotrophin Family of Neurotrophic Factors: An Overview. in Neurotrophic Factors: Methods and Protocols (ed. Skaper, S. D.) 1–12 (Humana Press, 2012).

[2] Huang, E. J. & Reichardt, L. F. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677–736 (2001). doi: 10.1146/annurev.neuro.24.1.677

[3] Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A. & Jessell, T. M. Directed Differentiation of Embryonic Stem Cells into Motor Neurons. Cell 110, 385–397 (2002). DOI: 10.1016/s0092-8674(02)00835-8

[4] Rigamonti, A., Repetti, G.G., Sun, C., et al. (2016). Large-scale production of mature neurons from human pluripotent stem cells in a three dimensional suspension culture system. Stem Cell Reports 6, 993–1008. DOI: 10.1016/j.stemcr.2016.05.010

[5] Rodriguez-MuelaN, Litterman NK, Norabuena EM, et al. Single-Cell Analysis of SMN Reveals ItsBroader Role in Neuromuscular Disease. Cell Rep. 2017 Feb 7;18(6):1484-1498.doi:10.1016/j.celrep.2017.01.035. DOI: 10.1016/j.celrep.2017.01.035

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