使用熱穩定的FGF-2（bFGF）和無動物源的TGF-β1，改進集落均一性的Weekend-free iPSC培養

01   概覽

無飼養層（Feeder-free）的(de)人(ren)誘導(dao)多能干細胞(bao)（iPSCs）培(pei)養是一個高度重復且常規的(de)過程(cheng)，但由于培(pei)養基的(de)投入(ru)以及需要頻繁更(geng)換培(pei)養基，可能會導(dao)致(zhi)成本高昂(ang)。

培養基的(de)額外成(cheng)本主要基于(yu)兩個核心細胞(bao)間(jian)通(tong)訊生(sheng)長因(yin)子(zi)的(de)需求，即成(cheng)纖維(wei)細胞(bao)生(sheng)長因(yin)子(zi)2（FGF-2）和轉化(hua)生(sheng)長因(yin)子(zi)B1（TGF-B1），它們需要在精確濃(nong)度(du)下(xia)存在以維(wei)持iPSCs的(de)干性/多能性。然(ran)而，要在體外環境中實現這一點具有(you)挑(tiao)戰性，主要是(shi)由(you)于(yu)FGF-2的(de)快速降解(jie)，其有(you)效半衰期小于(yu)10小時，導致需要每(mei)天(tian)更換培養基。

在本應用說明中，我們描述了一種使用包含Qkine熱穩定FGF2-G3（Qk053）和TGF-B1 PLUS（QK010）生長因子的E8樣培養基來維持、培養和測試iPSCs多能性的方法。該過程展示了在不需要每日更換培養基的情況下對iPSCs進行維持、擴增和多能性評估，實現了無需周末維護（Weekend-free）的培養和擴增，同時保持了細胞的多能性和增殖潛力。

02   引言

人誘導(dao)多能(neng)(neng)干細(xi)胞（iPSCs）是(shi)一種體(ti)外模型，功能(neng)(neng)上是(shi)永生的(de)，能(neng)(neng)夠在保持(chi)分化為任何體(ti)細(xi)胞類型的(de)能(neng)(neng)力的(de)同(tong)時，進行增殖。由于iPSCs可以應用于各種研究領域，并且(qie)不像胚胎干細(xi)胞那樣面臨相同(tong)的(de)倫理問題，人們對(dui)iPSCs的(de)生成興趣(qu)有(you)所增加。

這就產生了培養大量單個iPSC系或各種不同iPSC系的需求，這增加了日常更換培養基的成本且耗時。這一需求推動了對細胞培養基中主要信號成分的識別工作，以有效培養iPSCs。FGF-2通過與FGFR1/FGFR4結合，激活PI3K/AKT/mTOR通路，而TGF-β1通過與TGFBR1/2結合，激活TGF-β通路，這兩者被強調為這些核心信號成分中的重要組成部分。

在日常維護中保持多能性(xing)對于以敏感性(xing)著稱的細(xi)胞培養(yang)如iPSCs來說(shuo)是一項挑戰。使用高(gao)純(chun)度(du)和(he)熱穩定的生長(chang)(chang)因(yin)(yin)(yin)子(zi)可以幫(bang)助降低這種風險，因(yin)(yin)(yin)為(wei)它們缺乏內毒素等雜質，減少了對基因(yin)(yin)(yin)穩定性(xing)的影(ying)響，并提供了更為(wei)一致的必要(yao)生長(chang)(chang)因(yin)(yin)(yin)子(zi)方(fang)案(an)。

E8樣培養(yang)(yang)基是一(yi)種(zhong)化(hua)學定義的(de)(de)培養(yang)(yang)基，這(zhe)(zhe)意味著它包含的(de)(de)未定義成分比(bi)其他復(fu)雜(za)培養(yang)(yang)基少(shao)，減少(shao)了變異性(xing)，并(bing)提高了個體iPSC系或各種(zhong)不同(tong)iPSC系培養(yang)(yang)之(zhi)間(jian)的(de)(de)可重復(fu)性(xing)。這(zhe)(zhe)種(zhong)配(pei)方已(yi)經過(guo)優化(hua)，可以(yi)支持細(xi)胞的(de)(de)強勁增(zeng)殖，同(tong)時確保iPSC的(de)(de)多(duo)(duo)能(neng)性(xing)保持不變，從而提高細(xi)胞產量并(bing)使培養(yang)(yang)的(de)(de)擴展更加一(yi)致。iPSCs的(de)(de)多(duo)(duo)能(neng)性(xing)可以(yi)通過(guo)檢測細(xi)胞內表面標志物(wu)如NANOG、SOX2和OCT-4來評估。

03   材料與方法

iPSC常規(gui)培養工作流程示意圖(tu)(tu)（圖(tu)(tu)1）概述(shu)了(le)(le)每日維持(chi)iPSC的(de)步驟，并展示了(le)(le)與使用標準協議的(de)區別。多能性評估(gu)時間表突出顯(xian)示了(le)(le)測試iPSC多能性保持(chi)情(qing)況的(de)重要時間點（圖(tu)(tu)2）。

圖1：iPSC的每周(zhou)例行維護(hu)時間表

圖2：多能性評估測試時間表

04   細胞培養和維護

iPSC每周傳代兩次，使用(yong)0.5mM EDTA進(jin)行(xing)細胞脫離，并以1:6的分裂(lie)比率(lv)接種在涂有vitronectin（5μg/ml）的6孔板中(zhong)，使用(yong)E8樣培養(yang)(yang)基進(jin)行(xing)培養(yang)(yang)（見表1）。傳代后(hou)的第(di)二天，移(yi)除已用(yong)培養(yang)(yang)基，并更(geng)換為(wei)5ml的新鮮培養(yang)(yang)基。

表1:E8樣培養(yang)基構建組(zu)件

添(tian)加的各(ge)組分使用(yong)前需進行無菌和過濾消毒

05   免疫細胞化學（ICC）

iPSC使(shi)用Accutase進行細胞脫(tuo)離(li)，以每(mei)孔(kong)500個細胞的密度(du)接種(zhong)在涂有(you)vitronectin（5μg/ml）的96孔(kong)板中(zhong)，并在含(han)有(you)ROCK抑制劑(ji)（Y-27632，10μM）的E8樣(yang)(yang)培養基中(zhong)培養。接種(zhong)后的第(di)二(er)天，移除(chu)ROCK抑制劑(ji)，每(mei)孔(kong)加入200μl E8樣(yang)(yang)培養基。

3天后，用(yong)4%多聚(ju)甲醛固定細胞，并使(shi)用(yong)稀釋在0.1% Triton X-100中的10%驢血清（donkey serum）進行封(feng)閉和(he)(he)透化。然后使(shi)用(yong)特異性抗(kang)(kang)(kang)體針對多能性標志物(wu)（OCT-4、NANOG和(he)(he)SOX2）在4°C下過(guo)夜免疫染色。隨后，洗滌iPSC，并與二抗(kang)(kang)(kang)驢抗(kang)(kang)(kang)小鼠AlexaFluor 647或驢抗(kang)(kang)(kang)山羊（Donkey anti-Goat）AlexaFluor488和(he)(he)Hoechst 33258一起孵育，然后在磷酸鹽(yan)(yan)緩沖鹽(yan)(yan)水(shui)（PBS）中成像(xiang)。使(shi)用(yong)EVOS M5000系統(tong)獲取明場和(he)(he)熒光(guang)圖像(xiang)。

06   結果

FGF2-G3和TGF-β1 PLUS能夠維(wei)持(chi)iPSC的多能性、形態外觀和標(biao)記物表達。

在包含Qkine FGF2-G3和TGF-β1 PLUS生長因子的E8樣培養基中培養了一個月的iPSC，始終表現出高密度而沒有自發分化。明場成像顯示了在整個時間段內保持良好的細胞形態，具有清晰的邊緣和緊湊的細胞，形成完整的圓形菌落（見圖3）。這些iPSC通過高水平表達多能性標志物NANOG、SOX2和OCT-4，保持了它們的多能潛力，如圖4所示。

圖3：在E8樣培(pei)養(yang)基中培(pei)養(yang)的細胞群體高度保持的形態外觀成(cheng)像

(A) 經過2次(ci)傳代和(he)7天培養后的成像(xiang)

(B) 經過4次傳代(dai)和(he)14天培(pei)養后的(de)成像

(C)經過8次傳代和28天培養(yang)后的成像(xiang)（比(bi)例尺=300μm）

圖4：在(zai)E8樣培養基中培養的iPSC的多(duo)能性標志(zhi)物(wu)的免疫細胞化學（ICC）成(cheng)像

(A) 明(ming)場(chang)圖像

(B) NANOG表達（綠色）

(C) OCT-4表達（紅色）

(D) NANOG、OCT-4和Hoechst 33258的組合(he)成像

(E) 染色菌落的(de)明場圖像

(F) SOX2表達(da)（綠色）

(G) SOX2和Hoechst 33258的組合成像（藍(lan)色(se)），比(bi)例尺=150μm

07   結論

iPSC在(zai)臨床和(he)研(yan)究領(ling)域的(de)重(zhong)要性(xing)(xing)日益增加，因為它們有潛力分化為人(ren)體(ti)內所有體(ti)細胞類型(xing)。成功(gong)的(de)分化依(yi)賴(lai)于(yu)在(zai)培養(yang)過程中保持iPSC的(de)多能(neng)性(xing)(xing)，因此需(xu)要使用正(zheng)確的(de)培養(yang)基。

本文展示的數據表明，在E8樣培養基中使用Qkine FGF2-G3和TGF-B1 PLUS熱穩定生長因子能夠保持iPSC的多能性，支持其增殖，同時避免了每日更換培養基的需求。

這些iPSC隨后被分化為各種胚層和細胞類型，進一步表明在結合Qkine的生長因子的無(wu)周末(Weekend-free )更(geng)換培(pei)養基(ji)條件(jian)下，其多能(neng)性得到了(le)保持。

與(yu)在E8型培養基中培養的(de)iPSC相比，雖(sui)然(ran)觀(guan)察到類似的(de)增殖(zhi)率(lv)，但自發(fa)分化的(de)水平較高(gao)，降低(di)了(le)用于(yu)未來工作(zuo)的(de)iPSC集落的(de)質量。這些細胞還需要(yao)每日更(geng)換培養基，導致維護培養物的(de)成本和(he)時間投入(ru)增加（數據可根據要(yao)求提供，后(hou)續也(ye)會發(fa)布(bu)新推文）。

QKine，總(zong)部位于(yu)(yu)英(ying)國劍橋，是(shi)一(yi)家通過 ISO9001:2015 認證的公司。作為蛋白質創新的指引者，產(chan)品范圍涵蓋了多(duo)個應(ying)用領域，旨在提高您研究的可(ke)重復性。QKine積極支持并創新于(yu)(yu)新興領域，如類(lei)器官和(he)器官芯片、細(xi)胞農業(ye)、再生醫學、合成水凝膠和(he)生物打印等。

憑(ping)借強大的制(zhi)造流程，QKine 生產高純度(du)、高品(pin)質(zhi)、無動物成分(fen)的生長因(yin)子、細胞因(yin)子和其(qi)他復雜蛋白質(zhi)， 可以(yi)通過提(ti)供批量(liang)預訂、批量(liang)訂單(dan)、定制(zhi)裝瓶和質(zhi)量(liang)保證(zheng)（QA ）來(lai)支持規模化和商業制(zhi)造。

關注我們，敬請期待更(geng)多(duo)QKine新聞！您可進入曼博生物(wu)QKine產品頁(ye)，詳細了解(jie)各類(lei)產品，也可搜索QKine官(guan)網獲取更(geng)多(duo)資(zi)料。