用于生產優化牛和豬等特定物種的培養肉和脂肪生長因子

細胞農(nong)業有改變食品生(sheng)(sheng)產(chan)的(de)潛力(li)，并(bing)影響未來幾代人的(de)健(jian)康和(he)福祉。通過培(pei)養動物細胞生(sheng)(sheng)產(chan)的(de)培(pei)育肉類、魚類、脂肪和(he)乳制品，具有廣闊(kuo)的(de)市(shi)場(chang)前景，但要將這些技術推向市(shi)場(chang)并(bing)實現(xian)成本平價，仍面(mian)臨許多(duo)挑戰。

用于培(pei)養(yang)這些細(xi)胞(bao)(bao)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基是研發的(de)一個重要(yao)領域。生物活性重組蛋白，尤(you)其是生長因(yin)子和細(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子，是大多(duo)數培(pei)育肉細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)基中的(de)關(guan)鍵(jian)成分，除了某(mou)些雞(ji)肉和魚類(lei)培(pei)養(yang)基。生長因(yin)子蛋白具有高度活性，能夠(gou)提供一組精心協調的(de)生化信(xin)號，以控制細(xi)胞(bao)(bao)的(de)生長和命(ming)運。

優化培育肉類和(he)脂肪培養基的當(dang)務之(zhi)急(ji)包括：

• 優化細胞(bao)培(pei)養基中的(de)蛋白成分(fen)，以(yi)支持在生物反應器條件下有效(xiao)集(ji)約的(de)細胞(bao)擴增，并(bing)在必要(yao)時支持成熟過程(cheng)

• 替(ti)代動物來源的成(cheng)分(fen)，包(bao)括胎(tai)牛血清（FBS）

• 建立一(yi)個符(fu)合監(jian)管、操作、經濟和(he)科學要求(qiu)的可信且穩固的供應鏈

一、物種特異性(xing)生長(chang)因子對于生產培育肉類(lei)是(shi)否必不可少？

許(xu)多人類(lei)生(sheng)長因(yin)子(zi)也會激活(huo)動(dong)物細胞，盡管現有(you)的數據有(you)限(xian)，無法充分(fen)理解跨物種生(sheng)物活(huo)性的相對(dui)效能和(he)特異性。然而，近期強烈(lie)建議(yi)培育肉類(lei)公司使(shi)(shi)用(yong)相同物種的生(sheng)長因(yin)子(zi)，或者至少使(shi)(shi)用(yong)非人類(lei)的生(sheng)長因(yin)子(zi)。盡管據我們(men)所(suo)知(zhi)，目前尚無正式指導方針，但根據頭部行業(ye)提交的反饋(kui)和(he)美國食(shi)品藥品監督(du)管理局（FDA）的新口頭建議(yi)，這似(si)乎(hu)是明確的發展方向。

使用與物種匹配的生物活性蛋白無疑會使監管機構的審查更加順利，有助于消費者的接受度，并可能提高能效(xiao)，從而有助于降低培養基的成本。迫切需要適當控制的比較數據，以展示生長因子對動物細胞的相對效能。迄今為止，這主要由于商業試劑的缺乏、現有試劑的質量不穩定以及缺乏使用等同生化質量的重組蛋白和良好表征的細胞系進行的開放獲取比較研究而成為一項挑戰。

為應對該(gai)領域的(de)科學(xue)和(he)監管需求(qiu)，我們正(zheng)在(zai)開(kai)(kai)(kai)發(fa)和(he)表征來(lai)自(zi)幾個相關物種的(de)相同生(sheng)化質(zhi)量的(de)生(sheng)長因子(zi)。與其他(ta)利益相關者合作，我們希望加速培(pei)養基的(de)開(kai)(kai)(kai)發(fa)，并為豬(zhu)和(he)牛的(de)誘導(dao)多能干細(xi)胞（iPSC）、胚胎(tai)干細(xi)胞（ESC）和(he)間(jian)充質(zhi)干細(xi)胞（MSC）培(pei)養生(sheng)成開(kai)(kai)(kai)放獲取(qu)的(de)數(shu)據。

二(er)、我們(men)是(shi)否需(xu)要為牛(niu)和(he)豬細胞培養基中的(de)所有生長因子開發新的(de)物種特異性形式？

對培育牛和(he)豬細(xi)胞培養基(ji)的生長因子(zi)進行分析(xi)，以識別三種物種之(zhi)間相同的蛋(dan)白質以及那些蛋(dan)白質序列不保守的生長因子(zi)，這些引(yin)發了(le)對潛在物種特異(yi)性(xing)活性(xing)和(he)監管需求的擔(dan)憂。

該(gai)分(fen)析(xi)包括序列保守性(xing)（見Table 1）和功能域(yu)分(fen)析(xi)（數(shu)據未顯示）。這(zhe)些數(shu)據以及行業優(you)先(xian)事項(xiang)已被用于在Qkine優(you)先(xian)開發與物種匹配的(de)生(sheng)長因子。以下生(sheng)長因子被應用于培育肉類(lei)和脂肪(fang)的(de)培養基配方中，并且(qie)在不(bu)同物種之(zhi)間的(de)保守性(xing)較差。

在此，我(wo)們重點關注FGF-2、TGFβ3和HGF：

• 成纖維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)生長因子(zi)2（FGF-2），也稱為堿性FGF，對(dui)于許多(duo)細(xi)(xi)胞(bao)系(xi)的(de)(de)增殖和維(wei)持干細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)多(duo)能性至關重要(yao)。

• 轉(zhuan)化(hua)生長(chang)因子β3（TGF-β3），用于(yu)間充質干(gan)細(xi)胞的維(wei)持和(he)成肌細(xi)胞的分化(hua)。

• 表皮(pi)生長因子（EGF），常用于促進間充質(zhi)、上皮(pi)和(he)其他(ta)細胞類型(xing)的增殖和(he)分化。

• 肝細胞生長因子（HGF），在(zai)牛成肌細胞的擴增和成熟(shu)中起(qi)重要(yao)作(zuo)用(yong)。

• 血(xue)小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB），是一種有(you)效有(you)絲分裂(lie)原，能(neng)促進細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖和(he)細(xi)(xi)胞(bao)質量的增(zeng)加。

• 白血(xue)病抑制(zhi)因(yin)子（LIF），用于維持或衍生(sheng)某些類型的干細胞(bao)。

Table 1a: 在人類、牛和豬之間更為保守的生長因子

Table 1b: 在人類、牛和豬之(zhi)間不保守的生長(chang)因子蛋白

三、物種特異(yi)性的(de)FGF-2（bFGF）補充劑改(gai)善了(le)豬誘(you)導(dao)多(duo)能(neng)干細胞（iPSCs）的(de)多(duo)能(neng)性維持，并揭(jie)示了(le)兩種長度的(de)FGF-2在(zai)效力上的(de)差異(yi)。

FGF-2通常用于調節多能干細胞（PSC）培養(yang)中(zhong)的(de)(de)(de)細胞增(zeng)殖和(he)分化。在(zai)(zai)ESCs和(he)iPSCs的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)培養(yang)基(ji)中(zhong)，FGF-2以短形(xing)式（145個氨基(ji)酸(suan)）或(huo)較長(chang)形(xing)式（154個氨基(ji)酸(suan)）的(de)(de)(de)形(xing)式加入，后者包括(kuo)核心結(jie)構區域(yu)和(he)N-末端延(yan)伸。無論細胞來源物(wu)種(zhong)如何(he)，人(ren)類(lei)FGF-2通常用于動物(wu)干細胞的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)培養(yang)基(ji)中(zhong)。或(huo)許不(bu)尋(xun)常的(de)(de)(de)是，FGF-2的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)活性在(zai)(zai)物(wu)種(zhong)間高度保(bao)守（數據(ju)未顯示）。牛和(he)豬FGF-2的(de)(de)(de)氨基(ji)酸(suan)序(xu)列相同(tong)，與(yu)人(ren)類(lei)蛋白質相比(bi)，有(you)兩個氨基(ji)酸(suan)的(de)(de)(de)差異。

豬誘導多能干細胞(bao)(bao)（piPSCs）能夠自我(wo)更新并分化為脂肪和肌肉(rou)細胞(bao)(bao)。這些特性(xing)使它們成為培(pei)育肉(rou)類的(de)理(li)想(xiang)候選(xuan)細胞(bao)(bao)。開(kai)發出適(shi)用于豬iPSCs的(de)理(li)想(xiang)生長培(pei)養(yang)基對于在長期細胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)中維(wei)持(chi)多能性(xing)至(zhi)關重要。豬iPSCs需要在其生長培(pei)養(yang)基中補充FGF-2以保(bao)持(chi)干細胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)。

在這項研究中，我們觀察(cha)到豬(zhu)和人(ren)類的Qkine FGF-2變體(ti)都表現(xian)出有利于(yu)成功培(pei)養(yang)(yang)(yang)piPSCs的生物活性。使用(yong)人(ren)類或(huo)豬(zhu)的FGF-2異(yi)構體(ti)培(pei)養(yang)(yang)(yang)piPSCs導致(zhi)維(wei)持(chi)正(zheng)常的菌(jun)落形(xing)態，如Figure 1所(suo)示。有趣的是(shi)，與在對照piPSC培(pei)養(yang)(yang)(yang)基中培(pei)養(yang)(yang)(yang)的相比，使用(yong)人(ren)類或(huo)豬(zhu)的145aa FGF2變體(ti)補充培(pei)養(yang)(yang)(yang)導致(zhi)piPSCs的生長速(su)率增加。然(ran)而(er)，當將標準維(wei)持(chi)培(pei)養(yang)(yang)(yang)基補充了(le)人(ren)類或(huo)豬(zhu)的154aa較(jiao)長的FGF2異(yi)構體(ti)時，豬(zhu)iPSCs的生長速(su)率明顯較(jiao)慢。

盡管存(cun)在這(zhe)些(xie)變(bian)(bian)(bian)化(hua)，每個使用Qkine FGF-2生長因(yin)子補充的(de)piPSC培養中(zhong)，多能性標記物(wu)OCT4和SOX2的(de)表達保持穩定。值得注意的(de)是，154aa的(de)豬(zhu)(zhu)FGF2變(bian)(bian)(bian)體（Qk056）顯示出更高的(de)OCT4/SOX2比(bi)率，支持在piPSC培養基(ji)中(zhong)利用豬(zhu)(zhu)特異性生長因(yin)子的(de)潛在益處。請注意，對照piPSC培養基(ji)已經含(han)有人類FGF-2，需(xu)要進(jin)一步(bu)的(de)研究(jiu)來充分(fen)闡(chan)明(ming)觀察(cha)到(dao)的(de)細(xi)胞增殖(zhi)變(bian)(bian)(bian)化(hua)的(de)機制(zhi)。

Figure 1: 用不同(tong)形式的FGF-2培養(yang)的piPSCs。piPSCs在含有100ng/ml Qkine FGF-2的培養(yang)基中培養(yang)。A）亮場顯微鏡圖(tu)像。B）生長曲線。C）多能性標記基因表達分析（OCT4/SOX2）。

piPSCs使用(yong)Geltrex包被的(de)(de)(de)(de)6孔(kong)板上(shang)的(de)(de)(de)(de)reLEsR進行(xing)團塊傳代(dai)(dai)。piPSCs在(zai)含有(you)100ng/ml FGF-2（QK025、Qk027、Qk040和Qk056）的(de)(de)(de)(de)豬(zhu)iPSC培(pei)養基中(zhong)進行(xing)了(le)至(zhi)少5個傳代(dai)(dai)的(de)(de)(de)(de)培(pei)養。在(zai)第5代(dai)(dai)，建立了(le)每(mei)種生長(chang)(chang)因子培(pei)養的(de)(de)(de)(de)piPSCS的(de)(de)(de)(de)生長(chang)(chang)曲線(xian)。使用(yong)Accutase將piPSCs解離成單個細胞(bao)(bao)，并在(zai)Geltrex包被的(de)(de)(de)(de)24孔(kong)板上(shang)，每(mei)孔(kong)500μL含有(you)1x revita細胞(bao)(bao)補充劑的(de)(de)(de)(de)培(pei)養基中(zhong)，以10,000個細胞(bao)(bao)/孔(kong)的(de)(de)(de)(de)密度接種。在(zai)接下來的(de)(de)(de)(de)5天(tian)中(zhong)，每(mei)天(tian)用(yong)含有(you)每(mei)種FGF-2變體的(de)(de)(de)(de)500μL培(pei)養基培(pei)養細胞(bao)(bao)。連續5天(tian)進行(xing)三重細胞(bao)(bao)計數，并建立生長(chang)(chang)曲線(xian)。

在(zai)含有FGF-2的培養基中(zhong)(zhong)傳(chuan)代(dai)5次后(hou)，收(shou)獲piPSCs并(bing)使(shi)用NEB Monarch Total RNA miniprep kit進行RNA提取(qu)。2μg的RNA轉化(hua)為2μg CDNA，使(shi)用Applied Biosystems高容(rong)量cDNA逆轉錄試劑盒。將cDNA樣品(pin)稀釋至5ng/μl用于qPCR，每個(ge)96孔PCR板孔中(zhong)(zhong)使(shi)用10ng的cDNA。對(dui)豬GAPDH（內參）、豬OCT4（多能性）和豬SOX2（多能性）的引(yin)物從IDT訂購。使(shi)用Quantstudio 1實時PCR系統進行qPCR。進行ΔΔCT分(fen)析以計算Qkine生長因子補充(chong)培養基與對(dui)照piPSC生長培養基中(zhong)(zhong)標記物OCT4/SOX2基因表達的相對(dui)倍增變化(hua)。

四(si)、耐(nai)熱(re)的牛/豬(zhu)FGF-2在培養(yang)中經過(guo)7天(tian)后仍保持生物活性，可以減少培養(yang)基更換的頻率，并(bing)提高與工藝放(fang)大的兼容性。

FGF-2本身不穩(wen)(wen)定(ding)，容易發生(sheng)蛋(dan)白水解(jie)降解(jie)和(he)(he)聚集。這種基本的(de)生(sheng)化不穩(wen)(wen)定(ding)性，造成(cheng)其在培(pei)養基中的(de)功能半衰期很短(duan)（<10小(xiao)時），是需要(yao)頻繁更換培(pei)養基并(bing)在干細胞增殖過程(cheng)中改(gai)善均一性的(de)重(zhong)要(yao)因素。多能干細胞培(pei)養的(de)質量對隨(sui)后細胞分化和(he)(he)成(cheng)熟過程(cheng)中的(de)細胞產(chan)量有重(zhong)要(yao)影響(xiang)。重(zhong)組牛/豬FGF2-G3蛋(dan)白是FGF-2的(de)一種耐熱(re)工程(cheng)形式(shi)，支(zhi)持開發優化的(de)物種特異(yi)性無血(xue)清培(pei)養基。

使用人類熱穩定的(de)(de)FGF2-G3改善iPSC培養計劃的(de)(de)作用已經(jing)有充分(fen)的(de)(de)記錄，而該蛋(dan)白在改善放(fang)大(da)規模和在生(sheng)(sheng)物加工放(fang)大(da)規模中(zhong)對細胞質量(liang)產生(sheng)(sheng)均一(yi)性(xing)和可控性(xing)影響的(de)(de)效用正在細胞農(nong)業社區進(jin)行(xing)調查研(yan)究。然而，適用于(yu)制造放(fang)大(da)規模的(de)(de)無標記牛(niu)/豬(zhu)FGF2-G3的(de)(de)蛋(dan)白形式(shi)之前尚未可得。在本研(yan)究中(zhong)，通過定量(liang)報(bao)告基因分(fen)析(xi)（Figure 2），顯示了牛(niu)耐熱型FGF-2的(de)(de)生(sheng)(sheng)物活(huo)性(xing)等(deng)效于(yu)野(ye)生(sheng)(sheng)型牛(niu)/豬(zhu)FGF-2。

Figure 2: 野生型(xing)牛/豬(zhu)FGF-2（黑色）和牛/豬(zhu)FGF2-G3（綠色）具有(you)等效的(de)生物活性。Qk080牛/豬(zhu)FGF2-G3（EC50 0.190 ng/ml）和Qk040野生型(xing)FGF-2（EC50 0.237 ng/ml）。

為了評估牛(niu)/豬FGF2-G3的(de)(de)功(gong)能半(ban)衰期的(de)(de)延(yan)長，蛋(dan)白在培(pei)養(yang)液中孵育(yu)48小時，以模(mo)擬細胞培(pei)養(yang)條件，然后(hou)進行生物活性分析。耐熱的(de)(de)牛(niu)/豬FGF2-G3與野(ye)生型蛋(dan)白相(xiang)比，在37°C條件下與培(pei)養(yang)液預孵育(yu)48小時后(hou)，保(bao)持完全的(de)(de)活性，而野(ye)生型蛋(dan)白則在培(pei)養(yang)中降解（Figure 3）。

我們的(de)結果(guo)表明，FGF2-G3的(de)功(gong)能(neng)半(ban)衰期從<10小(xiao)時（野生型）增加到>48小(xiao)時，與(yu)人類(lei)耐熱FGF2-G3蛋(dan)白(bai)觀察到的(de)情況類(lei)似(si)，這表明牛(niu)/豬FGF2-G3是(shi)培育(yu)肉(rou)類(lei)培養基優化的(de)合適替代品(pin)。請注意(yi)，盡(jin)管(guan)(guan)像FGF2-G3這樣的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)工程形式為生物過程的(de)優化和(he)放大提供了獨特的(de)希(xi)望，但是(shi)使用工程蛋(dan)白(bai)可能(neng)會帶(dai)來額外的(de)監管(guan)(guan)障礙。然而(er)，對細胞產量(liang)、培養計劃(hua)和(he)細胞培養的(de)均一性(xing)的(de)轉變影響可能(neng)會促使與(yu)監管(guan)(guan)機構進行額外對話。

Figure 3: 比較Qk040野生型（WT）FGF-2在0小時(shi)（綠色(se)）（EC50 0.237 ng/ml）和48小時(shi)（黑色(se)）（EC50 1.75 ng/ml）的(de)活(huo)性(xing)。

比較(jiao)Qk080 FGF2-G3在(zai)0小(xiao)時(shi)（綠色）（EC50 0.464 ng/ml）和48小(xiao)時(shi)（黑色）（EC50 0.606 ng/ml）的(de)活(huo)(huo)性。牛/豬FGF2-G3的(de)活(huo)(huo)性是(shi)使用轉(zhuan)染HEK293T細胞的(de)血(xue)清(qing)反(fan)(fan)應(ying)元件熒光素酶報告基因分析(xi)測(ce)定的(de)。細胞用FGF2-G3的(de)系(xi)列(lie)稀釋(shi)(shi)液處理3小(xiao)時(shi)，進行(xing)了(le)三(san)次重復實(shi)驗。WT FGF-2（Qk040）和FGF2-G3（Qk080）在(zai)條件培養基中稀釋(shi)(shi)，并在(zai)37°C下孵(fu)育。樣品在(zai)0小(xiao)時(shi)和48小(xiao)時(shi)時(shi)取(qu)樣。FGF-2的(de)活(huo)(huo)性使用Promega血(xue)清(qing)反(fan)(fan)應(ying)元件熒光素酶報告基因分析(xi)進行(xing)三(san)次重復測(ce)定。結果歸一化(hua)至0小(xiao)時(shi)的(de)最.大(da)反(fan)(fan)應(ying)。

五、TGF-beta家族蛋白概(gai)述及物種(zhong)特異性生長(chang)因子對(dui)豬iPSC培養的影響(xiang)

TGF-beta超(chao)家族包括Activin A、TGF-β1-3、GDFs、GDNF和(he)(he)BMPs。這個(ge)蛋白家族在(zai)調控許多發育(yu)和(he)(he)生理(li)過程(cheng)中(zhong)起著重要(yao)作用。Activin A和(he)(he)TGF-beta家族蛋白通常在(zai)牛和(he)(he)豬細胞培養中(zhong)使用的培養基中(zhong)是不可少(shao)的。

TGF-β1、TGF-β2和(he)TGF-β3是三個密切相關的(de)TGF-β蛋(dan)白(bai)(bai)，它們在(zai)體內具有不(bu)同(tong)的(de)生理作(zuo)用、組織分(fen)布和(he)發育表(biao)達模式(shi)。TGF-β1-3蛋(dan)白(bai)(bai)由(you)不(bu)同(tong)的(de)基(ji)因(yin)編碼，它們在(zai)體內表(biao)達出獨(du)特的(de)、有時是重(zhong)疊的(de)模式(shi)，并(bing)在(zai)細胞(bao)增殖(zhi)、生長(chang)、分(fen)化和(he)運(yun)動中(zhong)發揮不(bu)同(tong)的(de)功能(neng)。TGF-β蛋(dan)白(bai)(bai)是有效的(de)信號(hao)分(fen)子(zi)，主要(yao)通過Smad 2/3介導的(de)途徑發揮作(zuo)用，影響著細胞(bao)增殖(zhi)、生長(chang)、分(fen)化和(he)運(yun)動中(zhong)。

TGF-β1在(zai)(zai)人類(lei)、豬和(he)牛中(zhong)(zhong)更(geng)為保守(shou)，并且(qie)在(zai)(zai)許(xu)多商業ESC和(he)iPSC培養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)使用(yong)，包(bao)括Essential 8和(he)mTesR，這些培養(yang)基(ji)(ji)是培育(yu)肉類(lei)發展中(zhong)(zhong)使用(yong)的許(xu)多培養(yang)基(ji)(ji)的基(ji)(ji)礎。相比之下，TGF-β3在(zai)(zai)物種間并不保守(shou)，但也用(yong)于(yu)無血(xue)清培養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)，包(bao)括B8和(he)牛變種Beefy 9，以及許(xu)多間充(chong)質和(he)成年動物來源的干細胞(bao)培養(yang)基(ji)(ji)。

值(zhi)得(de)注意的(de)是(shi)，這(zhe)個蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)家(jia)族由于其結構復(fu)雜性(xing)而在制(zhi)造過(guo)程(cheng)中困(kun)難重重。蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)活(huo)(huo)(huo)性(xing)形(xing)式是(shi)二(er)硫鍵(jian)連接的(de)二(er)聚體(ti)，蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)單聚體(ti)形(xing)式是(shi)無生物活(huo)(huo)(huo)性(xing)的(de)。這(zhe)個生長因(yin)(yin)子家(jia)族的(de)需求很可能(neng)最終主導與生物活(huo)(huo)(huo)性(xing)重組蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)培(pei)養(yang)基(ji)組分(fen)相關(guan)的(de)商品成本，因(yin)(yin)為公司將擴大到>50升的(de)規模，然(ran)后進入試(shi)驗階段。針對這(zhe)一挑戰，正在探(tan)索幾種創新方法(fa)，包(bao)括(kuo)基(ji)因(yin)(yin)方法(fa)來消除(chu)或減少(shao)對這(zhe)些(xie)(xie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)需求；共培(pei)養(yang)和利用哺乳動(dong)物細胞在培(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中分(fen)泌(mi)這(zhe)些(xie)(xie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)；以及(ji)開發優化的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質和制(zhi)造工藝，以解(jie)決(jue)供應鏈的(de)能(neng)力(li)和成本問題。

改善供應鏈，首先是(shi)開發(fa)可(ke)靠的(de)物(wu)(wu)種特異性蛋白(bai)，并在(zai)這些數據基礎上開發(fa)具(ju)有(you)(you)改進的(de)制(zhi)造產量或生物(wu)(wu)學特性的(de)工程形式。在(zai)蛋白(bai)質(zhi)制(zhi)造過程中還存在(zai)創新的(de)潛(qian)力，以將其特別定制(zhi)為培育肉類產業的(de)需求(qiu)和規模。豬TGF-β3是(shi)使用無(wu)動物(wu)(wu)來源的(de)微生物(wu)(wu)發(fa)酵工藝制(zhi)造的(de)。這種蛋白(bai)的(de)生物(wu)(wu)活性與人類TGF-β3進行了直接比較（Figure 4、5），在(zai)人類細胞(bao)系上進行了定量熒(ying)光(guang)素酶報告基因分析，結果顯示具(ju)有(you)(you)等效(xiao)的(de)生物(wu)(wu)活性。這是(shi)令(ling)人鼓舞的(de)，并且表明可(ke)能(neng)存在(zai)將人類TGF-β3與豬蛋白(bai)進行同(tong)類替代的(de)可(ke)能(neng)性。

Figure 4: 豬、牛(niu)和人類(lei)TGF-β3的多序列(lie)比對顯示(shi)人類(lei)和豬TGF-β3之間的序列(lie)保(bao)守性約為98%，人類(lei)和牛(niu)TGF-β3之間的序列(lie)保(bao)守性約為99.%。

Figure 5：使(shi)用TGF-β3響應的(de)螢火蟲(chong)熒光素(su)(su)酶(mei)報告(gao)基因在HEK293T細(xi)胞中測定了人類和(he)豬TGF-β3的(de)活性。人類TGF-β3的(de)EC50=39.53 pg/ml，豬TGF-β3的(de)EC50=37.51 pg/ml。細(xi)胞用TGF-β3的(de)系列稀(xi)釋液處(chu)理6小(xiao)時，進行了三次重復實驗。測量螢火蟲(chong)熒光素(su)(su)酶(mei)活性，并歸一化(hua)至對照Renilla熒光素(su)(su)酶(mei)活性。

六、Qkine TGFβ1 維持(chi)豬iPSCs的多能性

使(shi)用來自龍生物技術公司（ Dragon Biotechnologies）的piPSC細胞系驗證了Qkine人類/豬/牛TGFβ1和人類TGFβ3在培(pei)(pei)養中的有效(xiao)性(xing)。當(dang)豬誘導多能干(gan)細胞（piPSCs）暴露于人類/牛/豬TGFβ1或人類TGFβ3時，表現出典型的菌(jun)落形態(tai)，并且與在標(biao)(biao)準(zhun)條件下使(shi)用標(biao)(biao)準(zhun)培(pei)(pei)養基培(pei)(pei)養的piPSCs相比，生長速度較(jiao)大(da)提高（Figure 6A-B）。在補充TGFβ1后(hou)，多能性(xing)標(biao)(biao)志物OCT4和SOX2的表達水(shui)平(ping)保持穩定(ding)，如Figure 6C所(suo)示。

Figure 6: 使(shi)用(yong)TGFβ1和TGFβ3培養的(de)piPSCs。piPSCs在(zai)補充了2ng/ml Qkine TGFβ1或(huo)TGFβ3的(de)培養基中培養。A）明場(chang)顯微鏡圖(tu)像。B）生(sheng)長曲線。C）多能(neng)性標志物（OCT4/SOX2）的(de)基因表(biao)達分析(xi)。

然而(er)，值得(de)注意的(de)(de)是(shi)，引入(ru)人(ren)類(lei)TGFβ3會導致OCT4表達(da)下(xia)降，這(zhe)表明單獨使用人(ren)類(lei)TGFβ3可(ke)能無法充分(fen)維持piPSCs的(de)(de)多能性，或(huo)者(zhe)可(ke)能誘(you)導其(qi)分(fen)化。人(ren)類(lei)和豬(zhu)蛋(dan)白質的(de)(de)等效(xiao)生物活性表明，在目前含有TGF-β3的(de)(de)人(ren)類(lei)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)中，可(ke)以(yi)直接(jie)替(ti)換為豬(zhu)TGF-β3，從(cong)而(er)開(kai)發出物種匹配的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)配方。需要進(jin)一步使用豬(zhu)細(xi)(xi)胞系進(jin)行工作，以(yi)確(que)定其(qi)在豬(zhu)細(xi)(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)中的(de)(de)相對效(xiao)力，這(zhe)將通過該生長因(yin)子的(de)(de)商業供應得(de)到促進(jin)。

七、HGF 展現物(wu)種特異性活性，這(zhe)表明(ming)使(shi)用(yong)人類 HGF 在牛細(xi)胞上的已發表數據可能需要重新(xin)評估(gu)。

HGF 是牛成(cheng)肌細胞(bao)擴增(zeng)和成(cheng)熟培養基中的(de)(de)重要生長因子。此前，Qkine 開發了(le)(le)一種優化(hua)的(de)(de)無動(dong)物來(lai)源的(de)(de)天(tian)然序列活性人類(lei)(lei) HGF 同(tong)功型 HGF NK1，因為所有現有的(de)(de)商業 HGF 蛋(dan)白都是使用動(dong)物或人類(lei)(lei)細胞(bao)蛋(dan)白表(biao)達(da)系(xi)統生產的(de)(de)，限制了(le)(le)它(ta)們在轉化(hua)研究中的(de)(de)應用。

為了(le)擴展物(wu)(wu)種(zhong)特異(yi)性(xing) HGF 的可用(yong)性(xing)，Qkine 生(sheng)產了(le)牛和豬(zhu)的 HGF NK1。使用(yong)報告基因(yin)測定法在人體細胞上比較(jiao)了(le)人類、牛和豬(zhu) HGF NK1 蛋白的活(huo)性(xing)。結果顯示，牛 HGF NK1 和豬(zhu) HGF NK1 在人體細胞上的生(sheng)物(wu)(wu)活(huo)性(xing)較(jiao)低，這表明 HGF（NK1）在不(bu)同(tong)物(wu)(wu)種(zhong)間存在活(huo)性(xing)差異(yi)。

Figure 7: 使用 Promega serum response element luciferase reporter assay (*) 在 HEK293T 細(xi)胞(bao)(bao)中測定人(ren)類和豬 HGF NK1 的(de)活性(xing)。人(ren)類 HGF (NK1) 的(de) EC50 = 1.56 ng/ml；豬 HGF (NK1) 的(de) EC50 = 3.86 ng/ml；牛 HGF (NK1) 的(de) EC50 = 7.71 ng/ml。細(xi)胞(bao)(bao)被三次重復處理(li)，并加入梯度(du)稀釋(shi)的(de) HGF NK1 處理(li)3小時。測量(liang)螢火蟲熒(ying)光素酶(mei)活性(xing)并標(biao)準化為對照 Renilla 熒(ying)光素酶(mei)活性(xing)。

來自人體細(xi)胞的(de)生物活性測(ce)定(ding)數(shu)據顯示 HGF NK1 表現出物種(zhong)特(te)異性差(cha)異。需要進一步使用牛和豬細(xi)胞進行實驗，以確定(ding)其對(dui)培養肉工藝開發的(de)影響。

培養(yang)肉、魚、脂肪和乳制品是快速發展(zhan)的(de)領域(yu)，具有影響全(quan)球可(ke)持(chi)(chi)續發展(zhan)的(de)潛力。Qkine 致力于通過擴展(zhan)商業(ye)上可(ke)用的(de)物種特(te)異(yi)性(xing)生長因(yin)子的(de)范圍，并支(zhi)持(chi)(chi)開(kai)放合(he)作、科學(xue)研究基(ji)礎(chu)和可(ke)信的(de)長期供應鏈，來支(zhi)持(chi)(chi)細胞(bao)農業(ye)領域(yu)的(de)發展(zhan)。

Qkine，總部位于英(ying)國劍橋，是(shi)一(yi)家(jia)通過(guo) ISO9001:2015 認證的(de)公司。作為蛋白質創新的(de)指引者(zhe)，產品范圍涵蓋了(le)多種應用領(ling)域(yu)，旨在(zai)提高您研究(jiu)的(de)可重(zhong)復性(xing)。QKine積極支持并創新于新興(xing)領(ling)域(yu)，如類器(qi)官和器(qi)官芯(xin)片、細胞農業、再生(sheng)醫學、合成水(shui)凝膠和生(sheng)物打印等。

憑借強大的制(zhi)造(zao)流程(cheng)，QKine 生產高純度、高品質(zhi)、無動物成分(fen)的生長因(yin)子、細胞因(yin)子和(he)其他復雜蛋白質(zhi)， 可(ke)以通過提(ti)供批(pi)量(liang)預訂(ding)、批(pi)量(liang)訂(ding)單、定制(zhi)裝瓶和(he)質(zhi)量(liang)保證（QA ）來支持(chi)規模(mo)化和(he)商(shang)業制(zhi)造(zao)。

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