用于測試抗靜脈(mo)畸形候選藥物的(de)人(ren)類細胞3D體外模型

引(yin)言

靜脈畸(ji)形（VMs）是(shi)常見的先天性血管(guan)畸(ji)形之一(yi)。標準治(zhi)療(liao)方法是(shi)手術和(he)/或(huo)硬化治(zhi)療(liao)，但由于病變的大小(xiao)或(huo)位置(zhi)，手術切除可(ke)能無法進行，并且(qie)畸(ji)形組織往往會再生，迫切需要開發醫(yi)療(liao)療(liao)法。作為該領(ling)域的突(tu)破(po)，近期的研究表明，大多數(shu)VMs是(shi)由內皮細胞(bao)（ECs）中(zhong)TIE2-PIK信(xin)號(hao)通(tong)路的體(ti)細胞(bao)獲得性功能突(tu)變引起(qi)的。針對VMs的分子藥物西(xi)羅莫(mo)司（也稱為雷(lei)帕霉素）可(ke)以(yi)通(tong)過抑(yi)制(zhi)mTORC2在體(ti)外減少Akt的完全作用，并且(qie)在臨床試驗中(zhong)西(xi)羅莫(mo)司可(ke)以(yi)減少VM病變[1,2] 。

然而，西羅莫司有一定(ding)的局限性(xing)；在體外，它(ta)不(bu)能使所有的分子/細胞VM異常正常化(hua)，在人體中它(ta)具有有效(xiao)的免(mian)疫抑制作用。此外，TIE2/PIK3CA突(tu)變(bian)陰性(xing)的VMs可能是由(you)不(bu)直(zhi)接與Akt信(xin)號通(tong)路(lu)相(xiang)關的基(ji)因突(tu)變(bian)引起的[3,4] 。

因此，目前(qian)的(de)臨(lin)床(chuang)治療很少具有治愈性，沒有臨(lin)床(chuang)藥物(wu)針(zhen)對(dui)突變的(de)TIE2或PIK。因此，研究(jiu)新的(de)分子(zi)藥物(wu)對(dui)于開(kai)發有效(xiao)的(de)個性化VM靶向醫(yi)療療法是必要(yao)的(de)。在(zai)(zai)這里，研究(jiu)者使用人脂(zhi)肪基質細(xi)胞(bao)（hASC）/臍靜脈內皮細(xi)胞(bao)（HUVECs）在(zai)(zai)纖維蛋白(bai)凝膠中的(de)3D共(gong)培(pei)養開(kai)發了VM體外模(mo)型。研究(jiu)者發現(xian)這個模(mo)型適合研究(jiu)由致病性TIE2突變引起(qi)的(de)細(xi)胞(bao)異常（間(jian)充質細(xi)胞(bao)分化、管形成(cheng)、ECM沉積）并測試候選(xuan)藥物(wu)的(de)效(xiao)力以正(zheng)常化細(xi)胞(bao)異常。

研(yan)究者(zhe)研(yan)究了雷帕霉素（作(zuo)為黃金(jin)標準）、阿(a)培利(li)司（PI3K抑制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)）、AZ03（由阿(a)斯利(li)康開發的TIE2抑制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)）的效果。流動對VM內皮細胞的影(ying)響也在由Finnadvance設計和(he)制(zhi)(zhi)造的微流體(ti)裝(zhuang)置中的hASC/HUVEC共培養(yang)系統(tong)中進行了測試。

材(cai)料與(yu)方(fang)法(fa)

在共(gong)培(pei)養模(mo)型中（下圖），首(shou)先在培(pei)養板(ban)上(shang)(shang)涂覆(fu)纖維(wei)蛋白凝膠，然后加載hASCs（20,000個細(xi)胞(bao)/平方厘米），數小時后在其(qi)上(shang)(shang)加載HUVECs（5,000個細(xi)胞(bao)/平方厘米）。使用由(you)FICAM（VA Cure合作組織）開發的(de)特定(ding)血管(guan)(guan)刺激培(pei)養基來增強內皮(pi)細(xi)胞(bao)管(guan)(guan)形(xing)成(cheng)。第5天加入(ru)不同藥物以(yi)評(ping)估(gu)其(qi)對增大的(de)內皮(pi)細(xi)胞(bao)管(guan)(guan)、ECM沉積和SMCs覆(fu)蓋的(de)影響。共(gong)培(pei)養模(mo)型在這種培(pei)養基中培(pei)養7天，然后用共(gong)聚焦顯微鏡固定(ding)和成(cheng)像。

為了檢(jian)查(cha)共培養模型中流動(dong)對管形(xing)成的(de)影響，微流體通道用纖(xian)連蛋白（100 μg/mL）涂(tu)覆，然后分別在(zai)數(shu)小時(shi)內加載hASCs（2×10?個(ge)細胞(bao)/mL）和HUVECs（2×10?個(ge)細胞(bao)/mL）。芯片分別在(zai)靜態模式和放置(zhi)在(zai)搖(yao)床上的(de)動(dong)態模式下進行培養。AKTIA 精密搖(yao)擺系統調整為25°角和 2 RPM以施加0.4-4.0 Pa的(de)剪切應力。

圖：AKITAPlate96-Blood VesselMacro & micro-vasculature

結果(guo)

1. 逆轉錄病毒轉導HUVECs的蛋白質印跡分析

使(shi)用逆轉(zhuan)錄病毒基因(yin)轉(zhuan)移在HUVECs中表(biao)達引起VM的(de)(de)(de)TIE2-L914F突(tu)(tu)變，TIE2-WT和不(bu)表(biao)達TIE2的(de)(de)(de)HUVECs用作對照。細胞使(shi)用雙順(shun)反子IRES載體轉(zhuan)導，因(yin)此轉(zhuan)導的(de)(de)(de)細胞也表(biao)達GFP標(biao)記基因(yin)（IG）。圖1顯示HUVECs IG與(yu)正常HUVECs相似，WT和突(tu)(tu)變體中TIE2的(de)(de)(de)表(biao)達水平(ping)相似，研(yan)究者的(de)(de)(de)目標(biao)是WT和突(tu)(tu)變體之間的(de)(de)(de)差異在于突(tu)(tu)變體中的(de)(de)(de)TIE2磷(lin)酸(suan)化。

圖1. (A) 顯示了免疫沉淀中(zhong)的TIE2表(biao)達(da)和磷酸(suan)化水(shui)(shui)平，(B, C) 顯示了蛋白質(zhi)印跡(ji)中(zhong)TIE2和Akt的水(shui)(shui)平以及抗肌動蛋白。右側顯示了蛋白質(zhi)印跡(ji)信號的定量結果。

2. 正常、TIE2WT和TIE2L914FHUVECs的形態及(ji)治(zhi)療（阿培(pei)利司(si)、雷帕霉素和Az03）對人脂肪(fang)干細胞(bao)/內皮細胞(bao)共培(pei)養模型中血管(guan)結構的影響，內皮細胞(bao)用CD31染色，aSMC表示hASCs向平滑肌(ji)樣細胞(bao)的分化，ECM用ColIV染色。（圖2）。

圖2：A & A1, B & B1）正常(chang)和TIE2WT HUVECs形成了管(guan)(guan)狀(zhuang)網絡，如其他人以前所(suo)示。C & C1) TIE2L914F結(jie)果(guo)表現為異常(chang)增大的血管(guan)(guan)結(jie)構，Col IV分散，SMCs覆蓋較少。D & D1, E & E1, F & F1）顯(xian)示TIE2^L914F血管(guan)(guan)結(jie)構在(zai)處理Az03 1μM、阿培利司1μM和雷(lei)帕(pa)霉素100nM 48小(xiao)時(shi)后的變化(hua)。

3. 在微流體通道中加(jia)載膠原(yuan)蛋白1型（1mg/mL）的(de)hASCs和HUVECs混合物的(de)管(guan)狀形(xing)成（圖(tu)3）。

圖(tu)3. A, B和C）分別(bie)(bie)顯(xian)示(shi)(shi)了hASCs與正常、TIE2WT和TIE2L914F HUVECs共培養的管狀形成。D, E）分別(bie)(bie)顯(xian)示(shi)(shi)了靜態和動(dong)態模式下(xia)的COL IV沉積。F）顯(xian)示(shi)(shi)了流動(dong)對(dui)靜態和動(dong)態模式下(xia)管狀結構取向的影響(xiang)。

4. 血管和SMCs直徑(jing)及體(ti)積的定量(liang)分析

圖4意味著血管(guan)相(xiang)對的SMCs覆(fu)蓋率在TIE2L914F中(zhong)更(geng)低(di)，并且在TIE2L914F中(zhong)通過阿培利司和AZ03 TIE2抑制劑得到了抑制。

圖(tu)4：A) 管(guan)(guan)(guan)(guan)道（COL IV）直徑(jing)測量顯示(shi)，經過阿培利司(si)和AZ03治療后，異(yi)常增大的血(xue)管(guan)(guan)(guan)(guan)數量減少。B) 使用Imaris進行3D渲染，測量每個血(xue)管(guan)(guan)(guan)(guan)和SMCs，并繪(hui)制(zhi)SMCs體積與(yu)血(xue)管(guan)(guan)(guan)(guan)體積的比例(li)。

結(jie)論

在本(ben)研究中(zhong)，研究者開發(fa)了一個使(shi)用hASCs和(he)引起靜脈畸(ji)形的(de)逆轉錄病(bing)毒(du)轉導HUVECs的(de)3D體外共培(pei)養模型。

該(gai)3D模型在三個主要方(fang)面模擬了靜脈畸形(xing)，包括增大的(de)血(xue)管、異常組織的(de)血(xue)管周圍ECM和較(jiao)低的(de)SMC覆蓋率[5] 。更有(you)趣(qu)的(de)是，該(gai)模型對(dui)(dui)TIE2抑制(zhi)劑(ji)有(you)反應，并顯(xian)示出用(yong)于進一步(bu)藥物(wu)篩選(xuan)的(de)高潛力。此外，使用(yong)微流體(ti)芯(xin)片并引入流動，研究者研究了流動對(dui)(dui)該(gai)體(ti)外疾(ji)病(bing)模型中ECM沉積取向(xiang)的(de)影響(xiang)。

參考文獻

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[2]Harbers, Veroniek EM, et al. "Patients with Congenital Low-Flow Vascular Malformation Treated with Low Dose Sirolimus." Advances in Therapy 38.6 (2021): 3465-3482.

[3]Castel P, et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Sci Transl Med 2016;8:332ra42.

[4]Huttala, Outi, et al. "Human vascular model with defined stimulation medium-a characterization study."(2015).

[5]Boscolo, Elisa, et al. "Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects." The Journal of clinical investigation 125.9 (2015): 3491-3504.

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