發布時間：2023/11/15 點擊數：701 
前言
CAR-T細(xi)胞治療(liao)的(de)生產流程(cheng)一般為通過(guo)白細(xi)胞分(fen)離(li)技術(shu)從(cong)患(huan)者(zhe)或健康供體收集單個(ge)核細(xi)胞，然后進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)T細(xi)胞群富(fu)集，最后用病(bing)毒(du)載(zai)體進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)基(ji)因(yin)修飾并進(jin)(jin)行(xing)(xing)(xing)體外CAR-T細(xi)胞擴增(zeng)。T細(xi)胞體外培養及擴增(zeng)并非(fei)易事，國家食品(pin)藥(yao)品(pin)監督(du)管理(li)總局組織制定的(de)《細(xi)胞治療(liao)產品(pin)研究(jiu)與評(ping)價技術(shu)指(zhi)導原則（試行(xing)(xing)(xing)）》中有明確指(zhi)出：“細(xi)胞培養過(guo)程(cheng)中，應盡量(liang)避(bi)免使(shi)用動物(wu)來源的(de)物(wu)質，比如(ru)應盡量(liang)避(bi)免血清的(de)使(shi)用，若必須(xu)使(shi)用血清，需要提供相關的(de)研究(jiu)資料(liao)說明使(shi)用的(de)必要性(xing)和合理(li)性(xing)；嚴(yan)禁(jin)使(shi)用疫(yi)病(bing)流行(xing)(xing)(xing)區(qu)來源的(de)動物(wu)血清；不(bu)得使(shi)用未經(jing)過(guo)安全性(xing)驗證(zheng)的(de)血清” 。
因此，探索更加安全(quan)、成分更加明確的血清替代物對于細胞(bao)治療產(chan)品的穩定持續(xu)生產(chan)至關重要(yao)。
實(shi)驗方法(fa)和準備
本研究使用人外周血T細胞，按照細胞標準處理流程，進行T細胞解凍和激活（CD3/CD28 T細胞激活劑）。使用含有IL-2和不同濃度細胞培養補充劑包括：美國Sexton品牌的PR hPL（病原體減少工藝制備的血小板裂解液以下簡稱hPL）、人AB血清、胎牛血清FBS的培養基，在12孔板中進行培養。解凍4天后使用CMV-GFP慢病毒顆粒進行體外轉導。使用血細胞計計數細胞進行T細胞擴增研究。使用抗CD4（ rpat4)、 抗CD8（ rpa-t8） 、 抗CD45RO（ uchl1） 、 抗CCR7（ 151503） 、 抗CD127（ HIL-7R-M21） 、 抗CD62L(sk11)抗體進行免疫染色，從而獲得相應的流式細胞檢測數據為進行T細胞表型研究。
實驗一：hPL和人AB血清對慢病毒轉(zhuan)導T細胞效率的影響
上圖3A中(zhong)顯示(shi)使用5%濃度的(de)(de)AB血(xue)清和hPL培(pei)養(yang)的(de)(de)T細(xi)胞在(zai)慢(man)病毒(du)轉導(dao)兩(liang)天(tian)后的(de)(de)GFP陽(yang)性(xing)百(bai)分(fen)比，一(yi)(yi)般轉導(dao)后兩(liang)天(tian)為這兩(liang)種培(pei)養(yang)補充劑(ji)對T細(xi)胞培(pei)養(yang)的(de)(de)間(jian)接影響(xiang)預(yu)計最小的(de)(de)時間(jian)點。B圖中(zhong)顯示(shi)轉導(dao)一(yi)(yi)周后GFP陽(yang)性(xing)的(de)(de)百(bai)分(fen)比， 這是(shi)可(ke)能間(jian)接影響(xiang)結果的(de)(de)時間(jian)點。轉導(dao)一(yi)(yi)周后的(de)(de)平(ping)均熒(ying)光強度在(zai)C圖中(zhong)顯示(shi)。每張圖圖數據(ju)顯示(shi)了來自(zi)一(yi)(yi)個供(gong)體的(de)(de)重復(n=3)的(de)(de)平(ping)均值和標準偏差(cha)。
通(tong)過以上實驗結果(guo)發現：
作為T細胞(bao)培(pei)養(yang)補充劑，5%的(de)使(shi)用濃(nong)度下，相(xiang)比較人(ren)AB血清(qing)，使(shi)用該hPL進行體外T細胞(bao)培(pei)養(yang)具有相(xiang)似的(de)病毒轉導效(xiao)率。
實驗二—hPL對T細胞擴增效率的影響
研究者繼續就T細胞在各種細胞補充劑中的擴增情況進行分析，將T細胞在含有5%不同補充劑（FBS/AB血清/hPL)的培養基中培養和擴增。在指定的日期內進行細胞總數計數。下圖4A中顯示4名捐贈者的測試結果，B圖顯示的是在第13天或第14天獲得的總擴增情況進行統計學計數。
通(tong)過以(yi)上(shang)實驗結果發(fa)現：
作為T細胞培養(yang)(yang)補充(chong)劑，5%的使用濃度下(xia)，相比較(jiao)人(ren)AB血清，使用該hPL進行(xing)體外T細胞培養(yang)(yang)具(ju)有相似的擴增倍數。
實驗三—hPL對于T細胞(bao)培養CD4和(he)CD8細胞(bao)比例(li)的影(ying)響
下圖5A顯示FACS數據來自(zi)一個供(gong)體(ti)外周血(xue)中(zhong)分離(li)的T細胞(bao)經5%濃度的hPL培養(yang)后經流式細胞(bao)儀分析的CD4和(he)CD8細胞(bao)分布的散點(dian)圖。B圖顯示了在含有不(bu)同5%補充劑的培養(yang)基中(zhong)培養(yang)和(he)擴增14天(tian)后的CD4/CD8比值的平均值和(he)標準差（來自(zi)4個供(gong)體(ti)）。
通過(guo)以上實驗結(jie)果發現(xian)：
使用5% 的(de)hPL作為(wei)細胞(bao)補充劑(ji)進行T細胞(bao)體(ti)外培養，有助于維持(chi)T細胞(bao)CD4/CD8比例在40/60-60/40的(de)范圍內。
實驗(yan)四—hPL有助(zhu)于T細胞較低(di)分化水平(ping)的維持
本次研究中，我們(men)重點研究了(le)(le)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)化相關的(de)(de)(de)三類markers：CD45RO/CCR7/CD62L。下面7A中流式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)布數據點圖顯示(shi)(shi)了(le)(le)5%濃(nong)度的(de)(de)(de)不(bu)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)補(bu)充劑培養的(de)(de)(de)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（CD4+亞群(qun)）表型分(fen)析，與人(ren)AB血清(qing)相比，hPL具有較少的(de)(de)(de)不(bu)良(liang)分(fen)化TEM/ TEFF(CCR7細(xi)(xi)胞(bao)(bao))。所有被測(ce)試的(de)(de)(de)四個供體都顯示(shi)(shi)了(le)(le)這種表型的(de)(de)(de)變化。CD8亞群(qun)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)也顯示(shi)(shi)出一致的(de)(de)(de)趨勢，因篇幅(fu)問題這里就不(bu)一一演示(shi)(shi)了(le)(le)。7B圖中匯總數據顯示(shi)(shi)了(le)(le)在不(bu)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)補(bu)充劑中，TN, TCM, TEM, TEFF各自占比（左：CD4+亞群(qun)、右：CD8+ 亞群(qun)）。
進一步的，細胞(bao)解(jie)凍后在(zai)含(han)FBS/人AB血清/hPL補(bu)充(chong)劑的培養(yang)基中(zhong)(zhong)培養(yang)14-15天(tian)。下圖8A中(zhong)(zhong)顯示一個供體使用(yong)不(bu)同細胞(bao)補(bu)充(chong)劑的T細胞(bao)的CD62L熒光分布直方圖。左為CD4+亞群T細胞(bao)，右(you)為CD8+亞群T細胞(bao)。圖B中(zhong)(zhong)顯示了來自(zi)三個供體的CD62L+百(bai)分比(bi)和(he)(he)個體重(zhong)復(fu)百(bai)分比(bi)的平(ping)均值和(he)(he)標準差。組間采用(yong)統計分析進行(xing)單向方差分析。(*=p<0.05,**=p<0.001)
通過以上實驗結(jie)果發現：
hPL作為(wei)細(xi)胞(bao)補充劑進行T細(xi)胞(bao)體外培養，有助于支持T細(xi)胞(bao)維持較低的(de)分化水平狀態(tai)。
綜上所述，在本次研究中使用美國Sexton品牌的血小板裂解液hPL替代FBS或者人AB血清的最終實驗結果比較：1）使用hPL作為血清替代物培養T細胞，轉導效率、T細胞擴增率并無明顯影響。2）使用hPL作為血清替代物培養T細胞，有助于維持T細胞CD4/CD8比例在40/60-60/40的范圍內。3）使用hPL作為血清替代物培養T細胞，獲得的TN/ TCM比例相對較高，TCM也為AB血清培養組的3-5倍，有文獻記載TN/TM表型的維持與對于腫瘤長期殺傷能力的改善有一定相關性（J clininvest . 2008: Hinrichs et al.， Proc Natl academy Sci USA 2009)。此外，值得期待的是：當T細胞在hPL中培養時，某些轉基因表達更穩定意味著實現類似功能效果所需的慢病毒數量的減少。
因此美國Sexton品牌(pai)(pai)的(de)(de)血(xue)小(xiao)板裂解液hPL替代(dai)FBS或(huo)者人AB血(xue)清(qing)是CAR-T細胞治療的(de)(de)中(zhong)T細胞體外培(pei)養的(de)(de)理想培(pei)養基補充劑選擇，目前全球有數百個使用該品牌(pai)(pai)hPL產品的(de)(de)項(xiang)目在臨床階段，并且有相關文獻分享(xiang)！
精(jing)品推(tui)薦
美國SEXTON可以提供從研(yan)發到臨床級別T細胞培養專用血小板裂解(jie)液——nLiven PR，作(zuo)為(wei)細胞治療產業的(de)有效(xiao)工(gong)具(ju)，nLiven PR具(ju)備以下特點(dian)：
· 可(ke)替代(dai)性：作為培(pei)養(yang)基補充劑，替代(dai)胎牛血(xue)清FBS或人AB血(xue)清用(yong)于體外(wai)T細胞的培(pei)養(yang)，具(ju)有相似的轉導效率以及擴(kuo)增倍數
· 安全(quan)性：在ISO9001認證的(de)設(she)施中驗證了(le)病(bing)原(yuan)體的(de)減少，并進行了(le)無菌，支(zhi)原(yuan)體和(he)內(nei)毒素等測試(shi)
· 重現性：通過匯集來自AABB認證/FDA注冊血(xue)液中心的100多名美國(guo)健(jian)康(kang)人體血(xue)液捐獻者，最大限度地減少了批(pi)間差異
· 可靠性：生(sheng)產廠家正規，供(gong)貨可靠，價格(ge)穩定
· 合(he)規性：在歐(ou)洲藥(yao)典5.2.12.4章則要(yao)求的(de)環境下生產，獲BMF認證(zheng)
