發布時間：2023/09/06 點擊數：487 
前言
近(jin)年來，隨著許多與疾病和細胞過(guo)程相(xiang)關的(de)基因被確(que)定(ding)為治(zhi)療的(de)潛(qian)在靶點，生(sheng)物療法(fa)已成為很多疾病的(de)有效治(zhi)療方法(fa)。據估計，每年都有數百種(zhong)生(sheng)物療法(fa)候選(xuan)藥物被開(kai)發出來。
基(ji)(ji)(ji)因治療(liao)(liao)與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)(liao)都屬于生(sheng)物(wu)療(liao)(liao)法范疇。基(ji)(ji)(ji)因治療(liao)(liao)是(shi)將轉基(ji)(ji)(ji)因材料轉移到患者的組織(zhi)或細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)，達(da)到糾正異常(chang)基(ji)(ji)(ji)因引起的特(te)定疾病(bing)的目(mu)的。細(xi)(xi)(xi)胞(bao)治療(liao)(liao)是(shi)指(zhi)采(cai)用生(sheng)物(wu)工(gong)程(cheng)的方法獲取具(ju)(ju)有(you)特(te)定功(gong)能(neng)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，并通過體外擴增(zeng)、特(te)殊培養等處理(li)后，使這些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)具(ju)(ju)有(you)增(zeng)強免疫、殺死(si)病(bing)原體和(he)腫瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)等功(gong)能(neng)，從(cong)而達(da)到治療(liao)(liao)某種疾病(bing)的目(mu)的。然而，如(ru)何實現(xian)高(gao)效(xiao)(xiao)的基(ji)(ji)(ji)因遞送(song)是(shi)開(kai)發生(sheng)物(wu)療(liao)(liao)法藥(yao)物(wu)的關鍵限(xian)制因素(su)之一。目(mu)前，病(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體，例如(ru)腺相(xiang)關病(bing)毒(du)(du)(du)（AAV）和(he)慢病(bing)毒(du)(du)(du)（LV）載(zai)體等已(yi)成為生(sheng)物(wu)療(liao)(liao)法中(zhong)常(chang)用的遞送(song)工(gong)具(ju)(ju)，已(yi)被證明擁有(you)較高(gao)的安(an)全(quan)性和(he)高(gao)效(xiao)(xiao)的靶向遞送(song)能(neng)力。
AAV能夠穿透細胞膜從而將外源核酸分子引入到靶細胞中，并且AAV與目前已知的人類致病性疾病無關，能夠有效的作為遞送載體將目標核酸分子遞送給患者。慢病毒載體作為另一種選擇，能夠容納更大的目標因子，同時能夠整合到宿主基因組中實現長期表達。目前，新一代的慢病毒載體也在越來越多的臨床應用中表現出很低的安全性問題。此外，這些病毒載體還能夠將目標核酸分子引入到特定的宿主位點，從而實現高度特異性的表達。但是，病毒載體的獲取一直以來受到多方面因素的影響，轉染試劑便是其中的一個重要因素，極大的影響著轉染效率的高低，是決定最終病毒滴度的重要一環。目前市面上有很多不同的轉染試劑可供選擇，但很難評估和找到一個能夠在臨床和研究中同時兼具高效性和低毒性的轉染試劑。
Polysciences PEI
聚乙烯亞胺（PEI）作(zuo)(zuo)為體內(nei)外基(ji)因遞送(song)的(de)(de)金標準轉(zhuan)染試劑，已有悠久的(de)(de)歷史。PEI是一種陽(yang)離子聚合(he)物，可以與(yu)核(he)酸形成帶(dai)正電荷的(de)(de)復(fu)合(he)物，該復(fu)合(he)物容易和細(xi)胞(bao)(bao)(bao)表面相互(hu)作(zuo)(zuo)用，通過細(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)吞作(zuo)(zuo)用轉(zhuan)運到細(xi)胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)中，最終使PEI/核(he)酸復(fu)合(he)物遞送(song)到細(xi)胞(bao)(bao)(bao)核(he)。PEI介導的(de)轉(zhuan)染比(bi)其他方法更具有(you)優勢(shi)，首先(xian)PEI在(zai)不(bu)同(tong)的(de)細(xi)胞類(lei)型中都具有(you)良好的(de)耐受性(xing)，包括用于(yu)生物加工(gong)的(de)細(xi)胞系(xi)；其次，PEI對于(yu)貼壁和(he)懸浮細(xi)胞培(pei)養體系(xi)都具有(you)低(di)毒性(xing)和(he)相容性(xing)。
Polysciences 提供高品質的科研級和cGMP級轉染試劑，用于病毒載體/蛋白質工藝開發到臨床試驗以及商業化生產的平穩過渡。Polysciences 成立于1961年，憑借其長期制造獨特、高品質的特種化學品的悠久歷史，已經成為眾多開發基因/細胞治療產品知名企業值得信賴的合作伙伴。Polysciences 的科研級PEI MAX已被學術和工業客戶使用了十多年，是引用最多的轉染試劑之一。幾年前，Polysciences推出了一款易于使用的液體版本的PEI MAX，命名為Transporter 5，專注于提高使用的便利性。PEI MAX和Transporter 5均可以用于工藝開發。根據FDA指南開發臨床級產品涉及多個要素，擁有cGMP級原材料是確保病毒療法安全性和最終患者安全的最關鍵因素之一。2019年，Polysciences 根據美國FDA GMP指南推出了一款cGMP轉染試劑。除了cGMP指南外，Polysciences還執行質量控制程序，使MAXgene GMP成為符合高質量標準的經濟型轉染試劑，且作為用于人體臨床試驗和商業化的治療性病毒載體生產的原料。MAXgene GMP完成了PEI產品用于病毒載體工藝開發到商業化的無縫過渡。使用MAXgene GMP進行病毒載體的放大可以確保與使用科研級PEI MAX和Transporter 5 進行小規模工藝開發/臨床前試驗的產量相當。
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工藝開發到商業化生產過程
生物工藝(yi)生產放大順(shun)序
Polysciences 的(de)PEI轉染(ran)試劑具有許多(duo)優勢，使其成(cheng)為細(xi)胞/基因治(zhi)療(liao)藥(yao)物生產(chan)商進行工藝開發、臨(lin)床試驗和商業化生產(chan)值得信賴(lai)的(de)選擇。
1. 高品(pin)質(zhi)R&D和cGMP級的選擇
2. 高轉染效(xiao)率，兼顧低(di)毒性
3. 高(gao)度可重復性的病毒(du)/蛋白質產量(liang)（從培養皿到(dao)大(da)規模生物反應器）
4. 適用于穩(wen)定和瞬時轉染
5. 所有材料均(jun)在來源于美國(guo)，符合(he)ISO 13485質量體系標準
6. 高(gao)性價比
獲得高轉染(ran)效率的(de)(de)最(zui)佳PEI/DNA比例可能(neng)因細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)和其他(ta)檢測參數的(de)(de)差異(yi)有所不同。Gu等人(ren)對(dui)某品牌的(de)(de)轉染(ran)試劑(ji)和polysciences 的(de)(de)PEI MAX在三(san)重轉染(ran)懸浮HEK293細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)生產AAV進(jin)行了(le)比較(jiao)分(fen)析，結果顯示(shi)，使(shi)用PEI MAX所生產的(de)(de)病毒(du)滴度相較(jiao)該轉染(ran)試劑(ji)增加了(le)約3倍，具體使(shi)用參數如下：
01 高度可(ke)重復性
Polysciences 的(de)線性(xing)PEI被(bei)廣泛(fan)引用，PEI MAX和(he)Transporter 5被(bei)設計(ji)用于病(bing)毒載體研發(fa)和(he)工藝開發(fa)過程(cheng)，對于臨床試驗和(he)商(shang)業化(hua)，polysciences 推薦(jian)使(shi)用MAXgene GMP，它有粉末和(he)液(ye)體兩種形式(shi)，滿足(zu)基因/細胞治療原料的(de)質量(liang)和(he)監管要求。這三種產品(pin)都是完全水解(jie)的(de)，易于操作且提(ti)供更高的(de)轉染(ran)效率。
Polysciences PEI產品(pin)不同批次保(bao)持高度一致性。
3個不(bu)同(tong)批(pi)次的PEI轉(zhuan)染(ran)試(shi)劑將表達GFP的質(zhi)粒(li)轉(zhuan)染(ran)到懸浮HEK-293T細胞中，轉(zhuan)染(ran)后(hou)48h，通過流式細胞術檢測轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率，結果表明(ming)，3個不(bu)同(tong)批(pi)次的PEI的轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率沒有顯著差(cha)異。
02 低細胞毒性
轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)染(ran)(ran)(ran)(ran)后的(de)(de)細(xi)胞狀態極大的(de)(de)影響著最終的(de)(de)產毒(du)量，選擇適合(he)的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)染(ran)(ran)(ran)(ran)試(shi)(shi)劑能夠(gou)盡可能的(de)(de)減(jian)少因轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)染(ran)(ran)(ran)(ran)試(shi)(shi)劑導致細(xi)胞受損(sun)造成的(de)(de)細(xi)胞產毒(du)能力不足。Polysciences轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)染(ran)(ran)(ran)(ran)試(shi)(shi)劑具備高效(xiao)的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)染(ran)(ran)(ran)(ran)能力，同時兼顧低毒(du)性，能夠(gou)有(you)效(xiao)避免對(dui)細(xi)胞的(de)(de)損(sun)傷。
三(san)個(ge)(ge)不(bu)同批次(ci)的(de)(de)Polyciences PEI轉染懸浮HEK-293T細(xi)胞(bao)表達(da)單抗，使用VI-CELL細(xi)胞(bao)計數儀檢測(ce)轉染后(hou)24h和48h的(de)(de)細(xi)胞(bao)活(huo)性。數據顯(xian)示，所有細(xi)胞(bao)的(de)(de)活(huo)力均(jun)在90%以上，表明3個(ge)(ge)不(bu)同批次(ci)的(de)(de)均(jun)保持(chi)低毒性，且保持(chi)批次(ci)間一致(zhi)性。
03 高滴度
優化所有(you)protocol參數以產生高效的生物過程(cheng)(cheng)是(shi)至關重要(yao)的。選擇適合的轉染(ran)試劑(ji)尤其重要(yao)，因為它對整(zheng)個過程(cheng)(cheng)和最終產品(pin)的收率有(you)重大影響。
研究發現，使用(yong)polysciences的PEI轉染(ran)試劑，轉染(ran)效率(lv)(lv)高(gao)，細胞(bao)毒(du)性(xing)低。PEI MAX幾乎(hu)完全去乙酰(xian)化，這有助于提(ti)高(gao)轉染(ran)效率(lv)(lv)，同時(shi)使其成(cheng)為(wei)一種細胞(bao)毒(du)性(xing)更小的轉染(ran)試劑，也有研究證明(ming)利用(yong)PEI MAX在大型(xing)生物反(fan)應器中可以(yi)獲得(de)高(gao)滴度的AAV。
Polysciences PEI MAX產生高滴(di)度AAV病毒
Polysciences PEI MAX轉染(ran)懸(xuan)浮HEK293細胞生產(chan)rAAV8（CMV-eGFP），轉染(ran)后(hou)48h、72h和96h分別(bie)收樣，檢測rAAV8的(de)產(chan)量，結(jie)果表明(ming)隨著時間的(de)增加(jia)，表達量逐漸增加(jia)。
04 可拓展性和靈活性
Polysciences的(de)PEI轉(zhuan)染試劑適用于各(ge)種細胞(bao)系和(he)細胞(bao)類型(xing)。穩定(ding)和(he)瞬時(shi)轉(zhuan)染都可用，在貼(tie)壁和(he)懸浮培養中均可產(chan)生高(gao)產(chan)量病毒/蛋白。
由于許多病毒/蛋白的(de)制造工藝使(shi)用HEK293細(xi)胞(bao)和CHO細(xi)胞(bao)，這(zhe)里我們提供(gong)了(le)polysciences PEI和競爭對手的(de)PEI在這(zhe)兩(liang)種細(xi)胞(bao)中的(de)性能(neng)比(bi)較數據。
Polysciences PEI轉染試劑產生更高的(de)抗(kang)體：
結(jie)論(lun)
生(sheng)物(wu)(wu)療(liao)(liao)法已成(cheng)為一(yi)系列疾病的(de)(de)有效治療(liao)(liao)方(fang)法，在研究最終的(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)療(liao)(liao)法時，重(zhong)要(yao)的(de)(de)是回顧(gu)整(zheng)個開(kai)發(fa)過(guo)程。在保持(chi)質量和一(yi)致(zhi)性的(de)(de)基(ji)礎上(shang)，持(chi)續(xu)不斷的(de)(de)開(kai)發(fa)，最終產生(sheng)對患(huan)者(zhe)安全(quan)有效的(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)治療(liao)(liao)藥物(wu)(wu)是至關(guan)重(zhong)要(yao)的(de)(de)。作(zuo)為細胞/基(ji)因治療(liao)(liao)企(qi)業十多年來的(de)(de)重(zhong)要(yao)合作(zuo)伙(huo)伴，Polysciences 了解(jie)這一(yi)連(lian)續(xu)過(guo)程，也了解(jie)客戶從早期階(jie)段到關(guan)鍵(jian)試驗(yan)和最終藥物(wu)(wu)交付給患(huan)者(zhe)持(chi)續(xu)開(kai)發(fa)過(guo)程中對優質原材料的(de)(de)需求。
參考文章(zhang)
1. Aravindan, L., Bicknell, K. A., Brooks, G., Khutoryanskiy, V. V., & Williams, A. C. (2009). Effect of acyl chain length on transfection efficiency and toxicity of polyethylenimine. International journal of pharmaceutics, 378(1-2), 201-210.
2. Dai, Z., Gjetting, T., Mattebjerg, M. A., Wu, C., & Andresen, T. L. (2011). Elucidating the interplay between DNA-condensing and free polycations in gene transfection through a mechanistic study of linear and branched PEI. Biomaterials, 32(33), 8626-8634.
3. Daya, S., & Berns, K. I. (2008). Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical microbiology reviews, 21(4), 583-593.
4. Delafosse, L., Xu, P., & Durocher, Y. (2016). Comparative study of polyethylenimines for transient gene expression in mammalian HEK293 and CHO cells. Journal of biotechnology, 227, 103-111.
5. Durymanov, M., & Reineke, J. (2018). Non-viral delivery of nucleic acids: Insight into mechanisms of overcoming intracellular barriers. Frontiers in pharmacology, 9, 971.
6. Grieger, J. C., Soltys, S. M., & Samulski, R. J. (2016). Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Molecular Therapy, 24(2), 287-297.
7. Gu, B., Bhat, V., Dong, W., Pham, H., Pubill, S., Kasaraneni, N., ... & Seth, A. (2018). Establishment of a scalable manufacturing platform for in-silicoderived ancestral adeno-associated virus vectors. Cell and Gene Therapy Insights, 4(S1), 753-769.
8. Milone, M. C., & O’Doherty, U. (2018). Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia, 32(7), 1529-1541.
9. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., & Strohl, W. R. (2017). Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs, 31(4), 317-334.
10. Nimesh, S., Aggarwal A., Kumar, P., Singh, Y., Gupta, K., Chandra, R. (2006). Influence of acyl chain length on transfection mediated by acylated PEI nanoparticles. Int J Pharm. 7;337(1-2), 265-74.
11. Sawant, R. R., Sriraman, S. K., Navarro, G., Biswas, S., Dalvi, R. A., & Torchilin, V. P. (2012). Polyethyleneimine-lipid conjugate-based pH-sensitive micellar carrier for gene delivery. Biomaterials, 33(15), 3942-3951.
12. Sun, W., Zheng, W., & Simeonov, A. (2017). Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A, 173(9), 2307-2322.
13. Zakeri, A., Kouhbanani, M. A. J., Beheshtkhoo, N., Beigi, V., Mousavi, S. M., Hashemi, S. A. R., ... & Movahedpour, A. (2018). Polyethylenimine-based nanocarriers in co-delivery of drug and gene: a developing horizon. Nano reviews & experiments, 9(1), 1488497.
