發布時間：2022/09/21 點擊數：313 背(bei)景
干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(Stemcell)是一(yi)類(lei)具(ju)有(you)自我更新能(neng)力(li)的(de)多潛(qian)能(neng)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)來源于胚胎(tai)、胎(tai)兒(er)組織和成(cheng)年(nian)組織。根據發(fa)(fa)育(yu)階段(duan)，干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分為(wei)胚胎(tai)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和成(cheng)體干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。胚胎(tai)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)來源于著床前(qian)的(de)囊(nang)胚內(nei)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)團，一(yi)般受精后的(de)約(yue)第5天(tian)形成(cheng)人囊(nang)胚，每(mei)個早期的(de)囊(nang)胚包含兩種細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)：滋養(yang)層細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)產(chan)生胚胎(tai)的(de)支(zhi)持組織如胎(tai)盤；而(er)內(nei)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群則可發(fa)(fa)育(yu)成(cheng)內(nei)、中、外三個胚層，最終發(fa)(fa)育(yu)成(cheng)完整的(de)個體。當內(nei)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群在(zai)培(pei)養(yang)皿中培(pei)養(yang)時，我們稱(cheng)之為(wei)胚胎(tai)干(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（ES），ES細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)具(ju)有(you)無限(xian)增殖和多能(neng)甚至全能(neng)分化的(de)能(neng)力(li)使(shi)其在(zai)揭示生命、藥(yao)物(wu)篩選、新藥(yao)開(kai)發(fa)(fa)，移植治療及研(yan)究胚胎(tai)發(fa)(fa)育(yu)和疾(ji)病發(fa)(fa)生和遺傳(chuan)性(xing)疾(ji)病具(ju)有(you)廣闊的(de)應(ying)用(yong)前(qian)景。（參考文獻）
（圖片來源(yuan)于網絡）
飼(si)養(yang)(yang)層(ceng)(ceng)細(xi)胞培(pei)養(yang)(yang)法(fa)是一類經常使用的(de)胚胎(tai)干細(xi)胞的(de)體外培(pei)養(yang)(yang)方(fang)法(fa)，本文中(zhong)主要分享的(de)是在飼(si)養(yang)(yang)層(ceng)(ceng)hESC培(pei)養(yang)(yang)體系中(zhong)如(ru)何采用一種(zhong)無(wu)EDTA溫和的(de)GMP級膠原酶溶液的(de)方(fang)法(fa)進(jin)行(xing)hESC傳代的(de)方(fang)法(fa)。
一、實驗(yan)材料準(zhun)備
1. 成纖(xian)維細(xi)胞飼養層包被的培養板(ban)
2. 細(xi)胞刮刀
3. hESC 培(pei)養基
制備500ml完全培養(yang)基，將以下組分混合后過濾(lv)：
a. 390 ml ESC基礎(chu)培養(yang)基Knock-Out DMEM (Invitrogen)
b. 5 ml L-谷(gu)氨酰胺溶液(Invitrogen)
c. 5 ml 非必需(xu)氨基酸溶液 (Invitrogen)
d. 100 ml Knock-Out 血清替(ti)代物(Invitrogen)
4. hESC 完(wan)全(quan)培養基中(zhong)添(tian)加bFGF
a. 制備50 μg/ml bFGF儲(chu)存(cun)溶液(ye)：在(zai)1ml無菌蒸餾水溶解50 μg bFGF（美國Akron品牌cGMP rHu bFGF-155）, 過濾并(bing)分裝，存(cun)儲(chu)在(zai)-20℃備用；
b. 制(zhi)備含50 ng/ml bFGF的hESC培(pei)養基(ji)工(gong)作液: 在(zai)使用(yong)前在(zai)每1mL hESC完全培(pei)養基(ji)中加入1 μl bFGF儲(chu)存(cun)原液制(zhi)備成hESC工(gong)作溶(rong)液；
5. 膠(jiao)原酶(mei)NB6 (Nordmark)
a. 制(zhi)備20 mg/ml膠(jiao)原酶NB6儲存溶(rong)液(ye)：將1 g膠(jiao)原酶NB6產品溶(rong)解在50 ml的含鈣(gai)鎂離子的PBS緩沖液(ye)（PBS+）中，按(an)照0.5ml/支分裝后儲存于-20℃備用。
b. 制備1.25 mg/ml膠(jiao)原酶(mei)工作溶液：每(mei)0.5ml NB6膠(jiao)原酶(mei)儲存(cun)溶液加(jia)入7.5 ml of PBS，配(pei)制成濃度為1.25 mg/ml的膠(jiao)原酶(mei)工作溶液。
二、hESC傳代-膠原(yuan)酶法
注(zhu)意：所有(you)實(shi)驗步驟(zou)遵照無菌操作規范在生(sheng)物安全柜中操作。
1. 將PBS+緩沖(chong)液和(he)人ES細(xi)胞培養基在37℃和(he)5%的CO2環境中平衡；
2. 通過剝離和(he)抽(chou)吸操作從培(pei)養物中去除分化/囊性物質。
3. 從培養容器中吸取培養基，用PBS+緩沖(chong)液(ye)沖(chong)洗兩次。
4. 加入膠原酶工(gong)作液(例(li)如:器官(guan)培養皿加0.5 ml，6cm直徑培養板或25cm2細胞培養瓶加入1 ml，75 cm2長燒(shao)瓶計入3 ml)，在37℃孵(fu)育6-8min。
5. 吸出膠(jiao)原酶溶(rong)液(ye)，加入適(shi)量hESC培養液(ye)。
6. 使用(yong)(yong)移(yi)液器(qi)從(cong)器(qi)官培養皿(min)中收獲克隆菌(jun)落(luo)，或者需要從(cong)培養瓶中收集細(xi)胞克隆時，可以用(yong)(yong)細(xi)胞刮板輕輕地(di)刮下菌(jun)落(luo)。
7. 將細胞懸(xuan)浮液轉移(yi)到合(he)適的(de)離心(xin)管中，并使用(yong)移(yi)液器(qi)輕柔吹吸使細胞分散（獲得原成熟菌落(luo)的(de)1/10 -1/20大小的(de)細胞團(tuan)）。
8. 用培(pei)養基(ji)清(qing)洗培(pei)養容器一次，并(bing)將培(pei)養基(ji)轉移(yi)至(zhi)離心管中(zhong)。
9. 1200rpm，離心(xin)3min。棄上清，用bFGF的hESC完全培養基(ji)重懸細胞沉(chen)淀。
10. 提前向成纖維細(xi)胞(bao)(bao)飼養(yang)層包(bao)被的(de)培(pei)養(yang)板中(zhong)添加適量含bFGF的(de)新鮮hESC培(pei)養(yang)基(ji)，將細(xi)胞(bao)(bao)懸液轉移到上述(shu)培(pei)養(yang)板中(zhong)。
11. 補足(zu)培養基(ji)并搖(yao)勻(yun)，確(que)保hESCs均(jun)勻(yun)分在培養板(ban)中。
12. 37℃，5%CO2條件下(xia)培養。
更(geng)多的(de)膠原酶應用于間充質MSCs干(gan)細胞原代培養以及后續生物反應器中微載體上細胞消化實現工藝放大的(de)解(jie)離應用請聯系(xi)上海曼博。
參考文獻
1- Kiatpongsan S, Tannirandom Y, Virutamasen P. Introduction to stem cellmedicine(J]. Med Assoc Thai ,2006;89(1) :111-7.
