發布時間：2022/05/11 點擊數：788 3D細(xi)胞(bao)培養(yang)技術的誕生為科(ke)研(yan)人員(yuan)提供了更(geng)貼近(jin)真實(shi)體內環境(jing)的細(xi)胞(bao)模型，使他(ta)們可以(yi)在(zai)體外開展(zhan)更(geng)具有洞悉力和預測能力的細(xi)胞(bao)實(shi)驗，減少藥物研(yan)發失敗風(feng)險(xian)，縮短實(shi)驗周期并降低研(yan)發成本。3D細(xi)胞(bao)培養(yang)技術在(zai)藥物研(yan)發、干細(xi)胞(bao)培養(yang)、器官再生等研(yan)究領(ling)域已經展(zhan)現出了出色的表現。
2D細胞培(pei)養方法和3D細胞培(pei)養方法的比較
(圖片來自于網絡(luo))
3D細胞(bao)培養技術經歷了數十年的(de)(de)持續(xu)發展(zhan)，其應用(yong)(yong)方法(fa)也(ye)在不斷革新。目(mu)前(qian)的(de)(de)3D細胞(bao)培養方法(fa)依據其培養原(yuan)理(li)，主要分(fen)為基于支(zhi)架的(de)(de)3D細胞(bao)培養方法(fa)和無支(zhi)架的(de)(de)3D細胞(bao)培養方法(fa)兩(liang)大類。其中后(hou)者因其操作簡單(dan)方便、適(shi)合高通量的(de)(de)自(zi)動化操作、可以良好地模擬細胞(bao)微環境(jing)等特(te)點被(bei)廣泛地接(jie)受和應用(yong)(yong)。
無支(zhi)架的(de)3D細胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)方(fang)法依(yi)賴細胞(bao)(bao)自聚(ju)集(ji)的(de)特性使得細胞(bao)(bao)聚(ju)集(ji)成微球并保持三維構型進行培(pei)(pei)養(yang)。無支(zhi)架的(de)3D細胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養(yang)方(fang)法中，最為(wei)常用的(de)兩(liang)種是：
（1）使用超低吸附材質（Ultra Low Attachment）的細(xi)胞培養耗材進(jin)行培養；
（2）在(zai)液體懸(xuan)滴（Hanging Drop）中進行細(xi)胞培養(yang)。
ULA耗(hao)材培(pei)養方法（左圖）和懸滴培(pei)養方法（右(you)圖）
(圖片來自于網絡)
上海曼博生物提供瑞士InSphero公司的3D細胞培養耗材和工具，其Akura系列超低吸附微球培養板和Akura PLUS懸滴細胞培養系統是一種簡單、靈活且能兼容自動化操作和細胞成像平臺的3D細胞解決方案，適用于無支架的3D細胞模型的形成、培養、觀察和觀測。
ULA培養板（左圖）和(he)懸滴(di)系統（右圖）
關于瑞士InSphero公司
InSphero AG是瑞士(shi)蘇(su)黎(li)世聯邦理工(gong)學(xue)院(yuan)和(he)蘇(su)黎(li)世大學(xue)的(de)衍生公司，于2009年在瑞士(shi)施利倫成立，在美國和(he)德國設有分部。公司以(yi)“預測(ce)(ce)人(ren)體對于治療方案的(de)真實反(fan)應以(yi)改善世界范(fan)圍內的(de)病(bing)人(ren)生活”為(wei)愿景，是通過3D細(xi)胞培養技(ji)術開(kai)展(zhan)新藥(yao)(yao)測(ce)(ce)試(shi)的(de)領軍型服務商之一，為(wei)世界前十的(de)知名(ming)藥(yao)(yao)企(qi)和(he)化妝品制造企(qi)業提供過相關服務。
InSphero的3D細胞(bao)培養(yang)耗(hao)材(cai)和(he)工(gong)具是(shi)公司(si)在(zai)開展服務時(shi)依據(ju)實驗過(guo)程中的諸(zhu)多痛點(dian)問題研(yan)發(fa)和(he)制造的產(chan)品，也是(shi)該公司(si)日常開展3D細胞(bao)培養(yang)時(shi)會大量使(shi)用(yong)到的。
Akura系(xi)列超低吸附(fu)微球培養板
InSphero提供(gong)96孔和384孔兩種型(xing)號的超低吸附微球培養板，其外觀和常規(gui)的細胞微孔板相同，尺(chi)寸符合SLAS國際標準，可以輕松兼容(rong)各種相關(guan)的操作和儀器。
Akura系列96孔（左圖）和384孔（右圖）微球培(pei)養板
Akura系列(lie)超低吸附微球培養(yang)板用(yong)法(fa)簡單、易于上手，其實驗操作流(liu)程和傳(chuan)統的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)實驗相(xiang)同，主要包括細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)鋪板、細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)、實驗操作和樣品收(shou)取，所有的(de)(de)步驟都可(ke)以(yi)在一塊培養(yang)板中完成，避免了繁瑣的(de)(de)耗材更換或細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)轉(zhuan)移(yi)。適用(yong)于常規(gui)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)類型的(de)(de)3D培養(yang)實驗。
96孔（左圖(tu)）和384孔（右(you)圖(tu)）培養板(ban)的(de)操作(zuo)流程(cheng)
從近處觀察不難發現Akura系列超低(di)吸附微球培(pei)養板的精妙設(she)計(ji)之處：
96孔(kong)（左圖(tu)）和384孔(kong)（右圖(tu)）ULA微(wei)球(qiu)培養板(ban)
（1）細胞孔的超低吸附涂層經久耐用，可以保證長時間周期的細胞培養過程中不發生細胞貼壁的現象，亦不會從孔內脫落而黏附到細胞表面；
（2）細胞孔的底部擁有一個類似倒置煙囪形狀的深孔，可以為孔內的細胞提供額外的保護（其中96孔板的深孔結構是對稱的，384孔板的深孔結構是非對稱的）；
（3）深孔的上方有一個稱為SureXchange的小巧平臺，可以供移液吸頭停靠方便培養基更換；
（4）深孔的底部是直徑為1mm的平底觀察窗，可以進行方便和快速的觀察以及不失真的細胞成像；
（5）96孔超低吸附微球培養板擁有經過改良設計的細胞板蓋，可以有效減少培養基的蒸發；其底部厚度為0.8mm的COP材質，優秀的光學特性帶來更清晰的成像體驗；
（6）384孔超低吸附微球培養板的板壁為黑色，可以有效減少光學檢測實驗中的孔間信號串擾；其底部是厚度為20um的氣透膜，方便氣體的交換并適用于高內涵細胞成像實驗。
獨特的(de)設計使(shi)得Akura系列超低吸附微球(qiu)微孔板在3D細胞培養的(de)應用(yong)中擁(yong)有出色(se)的(de)表現，為客(ke)戶帶去全(quan)新的(de)操作體驗(yan)，幫(bang)助(zhu)使(shi)用(yong)者提高實驗(yan)成功率(lv)和穩定性(xing)。
與市面上常見的U型底的超低吸附細胞培養板相比，Akura系列超低吸附微球培養板的深孔和SureXchange設計可以使得培養基更換更加徹底（效率>90%）且對細胞微球的擾動更小，由此帶來了更高的洗滌效率和更低的微球損失率。
Akura系(xi)列ULA微球培養板 VS U型(xing)底ULA細胞培養板
左圖(tu)：多(duo)次培養(yang)基(ji)更換操作后化(hua)合(he)物(wu)殘留(liu)情況（綠色(se)線(xian)條表(biao)示(shi)Akura系(xi)列(lie)ULA板(ban)，其(qi)余線(xian)條表(biao)示(shi)不(bu)同百分比殘留(liu)的培養(yang)基(ji)更換策略下(xia)的U型(xing)底(di)ULA板(ban)）
右圖：多(duo)次培養(yang)基(ji)更換操(cao)作后細胞(bao)微球損失情況（綠色線(xian)條表(biao)示Akura系(xi)列ULA板，其余線(xian)條表(biao)示不(bu)同百分比細胞(bao)微球丟失時的U型底(di)ULA板）
在長周期培養的藥物測試應用場景下，耐用的超低吸附涂層和低細胞微球丟失率可以輕松應對長達4周的細胞培養需求。高洗滌效率保證了藥物濃度始終維持在較為穩定的波動范圍內，藥物濃度更加精準，藥物測試結果更加真實可信。
長周期(qi)培養(yang)過程中化合(he)物濃度波動情況（綠色線(xian)條表示Akura系列ULA板(ban)，紅色線(xian)條表示50%殘(can)留的培養(yang)基(ji)更(geng)換策略下(xia)的U型底ULA板(ban)）
U型底的(de)(de)超低(di)吸(xi)(xi)附板會(hui)造成(cheng)(cheng)細胞(bao)成(cheng)(cheng)像時(shi)的(de)(de)圖(tu)像扭曲，只能用于簡單的(de)(de)觀(guan)測，不(bu)適合有高(gao)分(fen)辨(bian)需求的(de)(de)細胞(bao)成(cheng)(cheng)像應用場(chang)景；而常(chang)規的(de)(de)平底超低(di)吸(xi)(xi)附板又因為底部面積大造成(cheng)(cheng)細胞(bao)分(fen)散難以聚集成(cheng)(cheng)球因此(ci)表現不(bu)佳。
Akura系列超低吸附微球培養板的平底深孔設計很好的平衡了這兩方面的因素，在實(shi)現良(liang)好的(de)細胞聚(ju)集效果(guo)的(de)基礎之(zhi)上(shang)滿足客戶清晰、不變形的(de)細胞成(cheng)像需求。其中，Akura 384孔超低吸附微球培養板底部的氣透膜厚度僅為20um，適用于高內涵細胞成像的應用場景。
Akura 384孔超(chao)低吸附微球(qiu)培養(yang)板(ban)(ban)和競品U型(xing)底超(chao)低吸附細胞培養(yang)板(ban)(ban)的成像效果比較
Akura系列超低吸附微球培養板的尺寸符合國際標準，可以兼容自動化的液體處理系統以實現高通量的實驗操作。在使用自動化液體工作站時，需要將吸頭設置為偏離中軸線1mm，并設置移液速度為中低速。為此，InSphero公司為常見的自動化液體工作站的設置參數提供了參考方案，研究人員可以以此為基礎快速開展實驗。
因為上述的諸多特性，科研人員使用Akura系列超低吸附微球培養板進行3D細胞培養可以得到更加穩定和具有洞悉力的3D細胞模型。通過細胞自聚集的實驗原理，使用者可以通過控制種植的細胞密度來實現對細胞微球大小的控制。在單次實驗中細胞孔中長成的細胞微球直徑可以達到200um左右，且各個孔中的細胞微球大小均一、穩定性良好；在多次重復實驗中，各個批次的細胞微球均一度高、細胞大小和代謝能力相近、批間差異小，有助于科研和工業客戶在整個實驗周期中得到更加真實和可靠的實驗數據。
單次實驗得到的細胞微(wei)球(qiu)的直徑均一性（左(zuo)圖）和多次實驗結果的批間穩定(ding)性（右圖）
Akura PLUS懸滴(di)細(xi)胞培(pei)養系統
InSphero提供具有特殊設計的3D細胞培養懸滴系統，該系統由一塊Akura PLUS懸滴板（用于細胞聚集成球的環節）和一塊Akura 96孔超低吸附微球培養板（用于后續的長期培養、高分辨成像和藥物測試等環節）構成，適用于較難進行聚集的細胞類型的3D培養實驗。其使用方法簡便，實驗操作流程主要包括懸滴形成、微球成熟、微球轉移等步驟，所有的步驟都可以兼容常規移液器、多通道移液器和自動化液體工作站。
Akura PLUS懸滴系統（左圖）和操作流程（右(you)圖）
Akura PLUS懸滴細胞(bao)培養(yang)系統中(zhong)的(de)(de)(de)懸滴板中(zhong)配有(you)一塊加(jia)濕墊，可以(yi)增加(jia)板內的(de)(de)(de)濕度以(yi)保持懸滴的(de)(de)(de)穩(wen)定。加(jia)濕墊的(de)(de)(de)中(zhong)部開有(you)正方(fang)形的(de)(de)(de)觀察(cha)窗，方(fang)便用戶進行簡單的(de)(de)(de)細胞(bao)觀察(cha)以(yi)確定細胞(bao)聚集(ji)情況和最佳的(de)(de)(de)微球轉(zhuan)移時間。
顯微鏡下觀(guan)察到的(de)(de)懸滴中的(de)(de)細胞隨時(shi)間的(de)(de)聚集情況(kuang)
懸滴板(ban)和培養(yang)(yang)(yang)板(ban)的(de)對應位置(zhi)(zhi)設有三個(ge)插(cha)銷(xiao)結構，幫助確定懸滴板(ban)和培養(yang)(yang)(yang)板(ban)的(de)相(xiang)(xiang)對位置(zhi)(zhi)。在(zai)進行微球(qiu)的(de)轉移時，只需要將懸滴板(ban)置(zhi)(zhi)于培養(yang)(yang)(yang)板(ban)上方并(bing)向懸滴板(ban)中加入新的(de)培養(yang)(yang)(yang)基(ji)，包含了細胞微球(qiu)的(de)液滴就會落入下(xia)方培養(yang)(yang)(yang)孔的(de)相(xiang)(xiang)應孔洞內。
步驟一(yi)：將單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液移入懸(xuan)滴(di)板中形成懸(xuan)滴(di)
步驟二：懸滴中的細胞聚集形成細胞微球
步驟三：將懸滴板中包含細胞微球的懸滴轉移至培養板中
步驟四(si)：在培(pei)養(yang)板(ban)中長期培(pei)養(yang)細(xi)胞并更換(huan)培(pei)養(yang)基(ji)
3D細(xi)胞培養耗材(cai)的選擇(ze)指南
InSphero 3D細(xi)胞培(pei)養工具
除了(le)3D細胞(bao)培養(yang)耗(hao)材，InSphero還(huan)專門研(yan)(yan)發了(le)3D細胞(bao)培養(yang)的相(xiang)關工(gong)具，可以輔助研(yan)(yan)究(jiu)人員更好的開展實驗。
斜(xie)立(li)支架（左圖）和細胞(bao)孵育箱（右圖）
Akura斜立(li)支架：可以幫助細胞培養板保持30度角傾斜，通過將細胞引導至孔的邊緣，促進細(xi)胞間的(de)有效聚集并提高細(xi)胞微(wei)球的(de)均勻性。支架由陽極氧化鋁材質制成，可以經受常規的清潔和消毒并反復使用。單個Akura斜立支架最多可以堆疊4塊Akura系列超低吸附微球培養板。
InSphero細胞孵育箱：是一種特殊設計的容器，可以在常規的細胞培養箱內形成局部的高濕度環境，減少培養箱開關門時濕度的波動對細胞培養板的影響。使用孵育箱可以有效(xiao)降低細胞培(pei)養板(ban)中的培(pei)養基蒸(zheng)發，減弱(ruo)邊緣孔效(xiao)應(ying)對實驗(yan)造(zao)成的不(bu)良影響并提高孔板(ban)的利(li)用(yong)效(xiao)率。
開(kai)關培養箱/孵育(yu)箱門時對(dui)細胞(bao)孵育(yu)箱（橙色(se)線(xian)條）和二氧化碳細胞(bao)培養（黑色(se)線(xian)條）內濕度(du)的影響
孵(fu)育箱配有獨立的(de)(de)水浴(yu)槽幫助維持箱內(nei)濕度，背部(bu)有孔洞確(que)保氣體(ti)交換順暢并幫助保持箱內(nei)的(de)(de)氧(yang)氣和二氧(yang)化(hua)碳濃度。孵(fu)育箱的(de)(de)磁性閉合系統允許進行單手的(de)(de)開(kai)關操(cao)作，賦予(yu)使用者良好的(de)(de)使用體(ti)驗。孵(fu)育箱由(you)鋁(lv)、不銹鋼和鋼化(hua)安全(quan)玻璃（ESG）制成，可以經受常規的(de)(de)清潔和消毒。單個(ge)InSphero細胞(bao)孵(fu)育箱最多可以堆(dui)疊(die)20塊Akura系列超低吸附微球(qiu)培(pei)養板(ban)。
