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簡介

近(jin)年來(lai)，體外3D細(xi)胞模型在藥物發現等項目中的應用不(bu)斷擴(kuo)展。穩定和準確的實驗數據要求細胞模型能夠經受多次的給藥、測試和長達數周的培養，這對培養環境提出了挑戰——如何長期、可控地保持溫度和濕度在適宜范圍內。

目前在培(pei)(pei)養(yang)過程中(zhong)經常(chang)遇到的(de)(de)不穩定因(yin)素(su)有許(xu)多，例如繁忙(mang)的(de)(de)項(xiang)目中(zhong)培(pei)(pei)養(yang)箱門經常(chang)開閉導(dao)致的(de)(de)箱內溫(wen)、濕(shi)、氣體濃度(du)等(deng)條件變(bian)化顯著，而濕(shi)度(du)不足又會造成培(pei)(pei)養(yang)基的(de)(de)大幅(fu)蒸發(fa)，對藥物濃度(du)和細胞狀態等(deng)造成影響(xiang)。對于細胞培(pei)(pei)養(yang)板而言(yan)，邊緣(yuan)位(wei)置的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)孔濕(shi)度(du)低于中(zhong)心(xin)位(wei)置的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)孔，因(yin)此培(pei)(pei)養(yang)基蒸發(fa)的(de)(de)也更為(wei)明顯，被(bei)稱為(wei)邊緣(yuan)孔效應（edge-effects）。

邊緣孔效應對于長(chang)時間周期的研究來說是一個不容忽視的問(wen)題——隨著培養基的蒸發，孔內的培養基成分和藥物濃度將增加，這可能導致孔內沉淀的出現，并增加孔間的數據差異。許多的(de)(de)研究人員會通過避免使(shi)用(yong)邊(bian)緣(yuan)孔(kong)來提高數據可重復性(xing)，從而浪費了多達38%的(de)(de)培(pei)養(yang)孔(kong)——對于96孔(kong)板(ban)而言，外(wai)圍(wei)的(de)(de)36個孔(kong)將被棄用(yong)。因此，實(shi)驗組須分(fen)布在多塊(kuai)培(pei)養(yang)板(ban)上以達到足夠的(de)(de)通量，增加了工作量和成本，同時降低了實(shi)驗中培(pei)養(yang)板(ban)布局的(de)(de)靈活性(xing)。

本應用說明中展示了一(yi)項(xiang)為(wei)期14天(tian)的(de)毒性檢測實驗(yan)，用于(yu)檢測藥(yao)物誘導的(de)肝損傷（DILI）[1]。實驗(yan)過程涉及間隔5天(tian)的(de)重復給藥(yao)，并使(shi)用InSphero的(de)Incubox細胞孵育箱（CS-10-001-00）減(jian)弱(ruo)邊緣孔效應和孔間差異，從而(er)完整地使(shi)用整塊(kuai)96孔培養板。

一(yi)、產品介紹

InSphero Incubox細(xi)胞孵育箱(xiang)是一種特殊設計的小(xiao)巧容器，可以直接(jie)放在傳統的二(er)氧化(hua)碳細(xi)胞培養箱(xiang)中，營造穩定溫度和濕度的局部環境，減少培養箱門打開時箱內濕度和溫度的波動（圖1）。Incubox的(de)尺(chi)寸是350mm x 375mm x 210mm，最多可以裝載20塊(kuai)標準尺(chi)寸的(de)細(xi)胞培(pei)養(yang)板，其磁(ci)性閉(bi)合(he)系(xi)統允許進行單手(shou)的(de)開關操(cao)作(zuo)，賦予使(shi)用(yong)者良好的(de)使(shi)用(yong)體驗(yan)。Incubox由鋁(lv)、不銹(xiu)鋼(gang)和鋼(gang)化(hua)安全玻璃（ESG）制成，可以經(jing)受(shou)常規的(de)清潔和消毒，并(bing)與培(pei)養(yang)箱常用(yong)的(de)各種(zhong)溶劑和去污(wu)程序兼容。

此外，Incubox還(huan)配有獨立的水浴(yu)槽幫(bang)(bang)助維持箱(xiang)內(nei)濕(shi)度，背(bei)部有孔洞確保氣(qi)體交換順暢(chang)并(bing)幫(bang)(bang)助保持箱(xiang)內(nei)的氧氣(qi)和(he)二氧化(hua)碳濃(nong)度。

圖1：InSphero Incubox細胞孵育箱（CS-10-001-00）

圖(tu)2比較了二(er)氧化碳培(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)和(he)Incubox細胞孵育箱(xiang)(xiang)在經歷(li)8個小時的(de)(de)數次開閉(bi)后(hou)內部相(xiang)對濕(shi)度測量值(zhi)的(de)(de)變化。打開二(er)氧化碳培(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)的(de)(de)門會(hui)導致(zhi)箱(xiang)(xiang)體(ti)內的(de)(de)濕(shi)度顯著下降，大約30分鐘后(hou)才會(hui)逐(zhu)漸恢(hui)復到90%以上(shang)，而(er)同時段Incubox內的(de)(de)相(xiang)對濕(shi)度保持不變。打開二(er)氧化碳培(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)和(he)Incubox的(de)(de)門會(hui)導致(zhi)兩個箱(xiang)(xiang)體(ti)內的(de)(de)濕(shi)度下降，但是Incubox內的濕度變化幅度遠小于二氧化碳培養箱內的濕度變化，且可以在幾分鐘內恢復到較高水平。因此，使用(yong)Incubox進行(xing)培養，細胞(bao)培養板的孔(kong)內蒸(zheng)發(fa)量，尤其是邊緣孔(kong)的蒸(zheng)發(fa)量將大大減少。

圖2：二氧化碳培(pei)養箱及(ji)Incubox細(xi)胞孵育(yu)箱內相對濕(shi)度隨箱門閉(bi)合的(de)變化

圖3顯示了在二氧化碳培養(yang)箱和Incubox細胞孵育(yu)箱（使用前平(ping)衡至(zhi)少1h）中放置5天的培養(yang)板，各孔內剩余的培養(yang)基體(ti)積(ji)。

圖3：細胞(bao)培(pei)養板換(huan)液后(hou)5天孔(kong)內(nei)剩余培(pei)養基體積（初始70μl）

二(er)、14天(tian)周期細胞毒性檢測實驗

1、簡介

本研究(jiu)在一項長達14天的(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)測試實(shi)(shi)(shi)驗(yan)中(zhong)(zhong)評價了Incubox對于實(shi)(shi)(shi)驗(yan)數(shu)據穩定性的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。實(shi)(shi)(shi)際上，類似的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)(shi)驗(yan)常(chang)被用于評估藥(yao)物(wu)引起的(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)性肝損傷（DILI）。在本次實(shi)(shi)(shi)驗(yan)中(zhong)(zhong)，使用原代人肝臟(zang)微組織（肝細(xi)(xi)胞/非實(shi)(shi)(shi)質細(xi)(xi)胞共培養(yang)(yang)(yang)）測試了不同(tong)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)物(wu)。整個(ge)實(shi)(shi)(shi)驗(yan)周期超過14天，每4至5天將更(geng)換培養(yang)(yang)(yang)基(ji)并(bing)重新給藥(yao)，以便研究(jiu)代謝物(wu)的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。對于這樣長周期的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞培養(yang)(yang)(yang)而言(yan)，減少實(shi)(shi)(shi)驗(yan)中(zhong)(zhong)培養(yang)(yang)(yang)基(ji)的(de)(de)(de)(de)蒸發至關(guan)重要(yao)。

2、實(shi)驗安排

商業化的(de)器官微(wei)組織(zhi)可以直接從供(gong)應(ying)商處購(gou)買(mai)，并使用(yong)(yong)Akura 96孔微(wei)球培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)板(ban)(ban)（CS-09-004-03）和InSphero驗(yan)證的(de)實(shi)驗(yan)方案進行(xing)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)[2]。實(shi)驗(yan)安排如圖4所示：在第0、5和9天更(geng)換培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)基，并加(jia)入不同(tong)濃(nong)度的(de)測(ce)試(shi)藥物——氯丙嗪（一種已知的(de)具(ju)有肝(gan)毒性的(de)物質）。圖5展示了細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)板(ban)(ban)的(de)布局(ju)，兩塊(kuai)相同(tong)排布的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)板(ban)(ban)分(fen)別置于(yu)二氧化碳培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)和Incubox細(xi)胞(bao)孵(fu)育箱中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)。細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)板(ban)(ban)的(de)每個孔內(nei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)有一個肝(gan)臟微(wei)組織(zhi)，每一列孔內(nei)的(de)細(xi)胞(bao)給不同(tong)濃(nong)度的(de)氯丙嗪，并于(yu)第14天使用(yong)(yong)3D細(xi)胞(bao)活力檢(jian)測(ce)試(shi)劑（Promega，CellTiter-Glo 3D assay）測(ce)定細(xi)胞(bao)ATP水(shui)平[3]。本實(shi)驗(yan)中(zhong)，僅A-D行(xing)孔內(nei)的(de)細(xi)胞(bao)被(bei)用(yong)(yong)于(yu)檢(jian)測(ce)。

圖(tu)4：實驗安(an)排

圖5：細(xi)胞培養板內藥物濃度(du)安排

3、結(jie)果

自第0天(tian)起，在培(pei)(pei)養(yang)后(hou)第5天(tian)（期(qi)間未更換培(pei)(pei)養(yang)基）進行掃描成像（圖(tu)(tu)6上圖(tu)(tu)）。在標準(zhun)培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)條件(jian)下培(pei)(pei)養(yang)的(de)平(ping)板(ban)顯示出受損的(de)肝微(wei)組織，這(zhe)可(ke)能是由于外層孔(kong)中(zhong)的(de)蒸發增加所致(zhi)。在二(er)氧化碳培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)(xiang)中(zhong)培(pei)(pei)養(yang)的(de)平(ping)板(ban)的(de)A行孔(kong)內，可(ke)以(yi)清楚地看到(dao)沉淀的(de)出現和較為疏散(san)的(de)微(wei)組織。然而，在Incubox中(zhong)培(pei)(pei)養(yang)的(de)整個平(ping)板(ban)孔(kong)內可(ke)以(yi)觀察到(dao)較為良好的(de)均勻性（圖(tu)(tu)6下圖(tu)(tu)）。

圖6：培養(yang)5天后的掃描成像(xiang)

圖7顯示了培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)14天(tian)后通過測量(liang)細胞(bao)ATP含(han)量(liang)得出的微(wei)組(zu)織活(huo)(huo)力(li)。熱(re)圖顯示，在二氧化(hua)碳培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)箱中培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)的培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)板（圖7左圖）A行孔內，低(di)氯(lv)丙嗪(qin)濃度時細胞(bao)的活(huo)(huo)力(li)有顯著下降。這些結(jie)果表明(ming)，細胞(bao)活(huo)(huo)力(li)受到培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基蒸發的影響。相反，在Incubox中的培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)板（圖7右圖），從A行到D行孔內，可以觀察到較為穩定的、劑量(liang)依賴的活(huo)(huo)力(li)衰減。

圖7：培(pei)養14天(tian)后細(xi)胞(bao)ATP含量測(ce)定值

為了闡述培(pei)(pei)養(yang)基蒸發效應(ying)(ying)對(dui)于實(shi)(shi)驗穩定性(xing)的影響(xiang)，繪(hui)制了不同(tong)培(pei)(pei)養(yang)條件下(xia)B-D行(xing)孔(kong)(kong)(kong)(kong)內或A-C行(xing)孔(kong)(kong)(kong)(kong)內（n=3）的劑量-活力曲線。B-D方(fang)案模擬(ni)了僅使用96孔(kong)(kong)(kong)(kong)板(ban)(ban)的內部60孔(kong)(kong)(kong)(kong)開(kai)展(zhan)實(shi)(shi)驗的場景，研究(jiu)人員經(jing)常(chang)選擇這(zhe)種(zhong)方(fang)法來防止(zhi)邊緣效應(ying)(ying)。在(zai)兩種(zhong)不同(tong)培(pei)(pei)養(yang)條件下(xia)，均可以獲得較為穩定的實(shi)(shi)驗數據以及平滑的劑量相應(ying)(ying)曲線。A-C方(fang)案模擬(ni)了使用96孔(kong)(kong)(kong)(kong)板(ban)(ban)的所有孔(kong)(kong)(kong)(kong)開(kai)展(zhan)實(shi)(shi)驗的場景（包括邊緣孔(kong)(kong)(kong)(kong)），二氧(yang)化碳培(pei)(pei)養(yang)箱(xiang)中培(pei)(pei)養(yang)板(ban)(ban)的實(shi)(shi)驗數據具有較大的變異(yi)，尤其(qi)是在(zai)低(di)化合物濃度下(xia)。而對(dui)于Incubox中的培(pei)(pei)養(yang)板(ban)(ban), 由于邊緣孔(kong)(kong)(kong)(kong)效應(ying)(ying)的減(jian)弱(ruo)，B-D行(xing)和A-C行(xing)之間的數據穩定性(xing)沒有太大差異(yi)。

4、結論

Incubox細胞(bao)(bao)孵育箱(xiang)(xiang)在(zai)標準的二氧(yang)化碳(tan)細胞(bao)(bao)培(pei)養箱(xiang)(xiang)內創造高(gao)濕(shi)度的局部環境(jing)，使(shi)得二氧(yang)化碳(tan)培(pei)養箱(xiang)(xiang)門(men)的開(kai)閉(bi)僅(jin)對Incubox內的濕(shi)度波動(dong)產生(sheng)較小(xiao)影(ying)響(xiang)。因(yin)此，培(pei)養板(ban)中(zhong)的培(pei)養基(ji)蒸(zheng)(zheng)發(fa)(fa)量顯(xian)著減(jian)少。在(zai)本實(shi)驗案(an)例中(zhong)，邊緣(yuan)孔效應大幅減(jian)弱，從而允許(xu)使(shi)用者充分(fen)利(li)用96孔板(ban)的所有(you)培(pei)養孔，且減(jian)弱了由(you)于培(pei)養基(ji)蒸(zheng)(zheng)發(fa)(fa)造成(cheng)的數據波動(dong)。使(shi)用Incubox進行細胞(bao)(bao)培(pei)養，96孔板(ban)中(zhong)的所有(you)孔都可(ke)以用于產生(sheng)穩定的實(shi)驗數據，且使(shi)得培(pei)養板(ban)具(ju)有(you)更高(gao)的靈活性(xing)并在(zai)單(dan)板(ban)上(shang)測(ce)試更多的實(shi)驗條件，最終減(jian)少工作量和成(cheng)本。

三、參考文獻(xian)

1. Proctor, William R., et al. “Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury.”Archives of toxicology 91.8 (2017): 2849-2863.

2. Messner, Simon, et al. "Transcriptomic, proteomic, and functional long-term characterization of multicellular three-dimensional human liver microtissues.” Applied in vitro toxicology 4.1 (2018): 1-12.

3. Promega CellTiter-Glo 3D Cell Viability assay protocol.