發布時間：2023/10/30 點擊數：370 本文概(gai)況
FDA 使用CN-Bio 的器官(guan)芯片系統（OOC） 探討了毒理學(xue)終點的供體間變(bian)異(yi)性。另(ling)外，如(ru)何(he)選擇(ze)最適合(he)的細胞組(zu)合(he)來(lai)準確地代(dai)表給(gei)定的群體，是減少變(bian)異(yi)性的關鍵。
前言
盡管我們(men)鼓勵客戶盡可(ke)能使用我們(men)目(mu)錄(lu)中經過(guo)驗證的細(xi)胞(bao)，但我們了解某些地理區域的進口限制會影響這一點。而且，您可能希望從頭開始開發自己的模型，擁有替代解決方案，甚至可能是內部開發的平臺。
然而，人類本身表現出(chu)種(zhong)內差異（例如(ru)，全(quan)球25%的(de)人口患有脂肪(fang)肝），并且在選(xuan)擇(ze)供體(ti)(ti)之(zhi)前必須仔細考慮供體(ti)(ti)的(de)年齡、性別、種(zhong)族以及(ji)環(huan)境暴露等因(yin)素，除了這種(zhong)固有的(de)基于人群的(de)變(bian)異性之(zhi)外(wai)，細胞供體(ti)(ti)間(jian)不同的(de)細胞提取方(fang)法也會(hui)引入(ru)額外(wai)的(de)變(bian)異性，此(ci)外(wai)還要(yao)對您選(xuan)擇(ze)的(de) OOC 平臺與未來的(de)使用環(huan)境（或應用程序）進行徹底的(de)測試。
因(yin)此，在進(jin)行(xing)自己的內部(bu)預驗證檢(jian)測時需要考慮什么(me)？接下(xia)來請看FDA如(ru)何(he)開展細胞的預驗證研(yan)究(jiu)：
對(dui)乙酰(xian)氨基酚(fen)對(dui) CN Bio Innovations 肝芯片中(zhong)原代人類(lei)肝細(xi)胞（PHH）功能(neng)影響的表征
微生理學系統（MPS），包括 OOC，正在被評估用于模擬人體生理、人類和動物疾病，以及用于監管測試的能力。傳統毒性測試使用動物模型來預測人體反應，然而，由于物種的差異，這些預測的準確性可能不一致。使用人體細胞的器官芯片系統（下圖）可以最大限度地減少這些差異。
A：CN Bio Innovations的(de)肝(gan)臟 MPS 平(ping)臺(tai)由 LC12 平(ping)板組(zu)成，平(ping)板與 MPS 驅動器相連(lian)，并(bing)裝載到擴展(zhan)底座上(shang)，擴展(zhan)底座與一臺(tai)PhysioMimix 控(kong)制器主機(ji)(ji)連(lian)接，主機(ji)(ji)可(ke)調節流量和預設參(can)數。
B：LC12 平板由一個支(zhi)架(jia)組成，原代(dai)人類肝細(xi)胞播種(zhong)在支(zhi)架(jia)上(shang)，并在微通道內形(xing)成3D微組織。培(pei)養基(ji)在支(zhi)架(jia)和(he)儲層(ceng)中(zhong)循(xun)環(huan)，不斷(duan)提供(gong)流動。
目(mu)的
眾所周知，原代(dai)人(ren)類肝(gan)細(xi)胞（PHH）在(zai)(zai)藥物代(dai)謝和藥物誘導等方面存在(zai)(zai)個體(ti)差異(yi)。因此(ci)，我們的(de)(de)目標(biao)是確定個體(ti)、平(ping)均(jun)個體(ti)以及(ji)混合供體(ti)/批次在(zai)(zai)基線表(biao)達和對已知肝(gan)毒素（對乙酰氨基酚，APAP）的(de)(de)毒性反應中的(de)(de)差異(yi)。
初步研究(jiu)表明，不同捐獻者的所有(you)基線終點以及對(dui) APAP 毒性作用的敏(min)感性都(dou)存在差異(yi)(yi)。本研究(jiu)在變異(yi)(yi)性、靈(ling)敏(min)度和特異(yi)(yi)性以及功效分(fen)析中也觀察到了這(zhe)一點。
這些(xie)發(fa)現表明(ming)，需要進行更多的研究(jiu)，以(yi)闡明(ming)在這些(xie)研究(jiu)中應如何選(xuan)擇(ze)細胞群和細胞組合(he)，從而準確地代表感興趣的人(ren)群。
方(fang)法
1.四個(ge)單(dan)一供體批(pi)次和(he)一個(ge) 5 供體集(ji)合批(pi)次，分別暴露于低劑(ji)量（1-2 mM）、中劑(ji)量（3-5 mM）或高劑(ji)量（10-13 mM）的對乙酰(xian)氨基酚（APAP）中長(chang)達(da) 96 小(xiao)時(shi)（下表）。
2.肝臟 MPS 與原代人類肝細胞 (PHH) 按 0.6x106 個細胞/孔的比例接種，劑量濃度隨機分配，以盡量減少蒸發造成的邊緣效應。
3.將(jiang)肝(gan)臟 MPS 連續暴(bao)露(lu)于 APAP 4 天(tian)，在(zai)第(di)(di) 4 天(tian)（暴(bao)露(lu)于 APAP 之前）、第(di)(di) 5 天(tian)（暴(bao)露(lu)后 24 小(xiao)時(shi)(shi)）、第(di)(di) 6 天(tian)（暴(bao)露(lu)后 48 小(xiao)時(shi)(shi)）和第(di)(di) 8 天(tian)（暴(bao)露(lu)后 96 小(xiao)時(shi)(shi)）收(shou)集培養基(ji)進行(xing)分(fen)析(xi)。
4.對培(pei)養基進(jin)行 Albumin, Urea, LDH, ALT, 和(he)AST分析。
5.變(bian)異性(xing)根據每批次的(de)平(ping)(ping)均(jun)標準偏差確定。靈(ling)敏度(du)/特(te)異性(xing)根據陽性(xing)結果的(de)數(shu)量計算(suan)。根據終點(dian)的(de)不同，陽性(xing)結果是指平(ping)(ping)均(jun)對照的(de) +/- 50% 的(de)變(bian)化(hua)。
6.根據終點的(de)(de)不同，功效和(he)樣本量(liang)的(de)(de)計(ji)算(suan)基于檢(jian)測(ce)到比對照組大或小50%的(de)(de)差異的(de)(de)能力(li)。
結果
1、基線白蛋白分泌量和對 APAP 反應的差異，可能會影響不同(tong)批(pi)次結果的解釋
圖(tu)1
不同(tong)(tong)批(pi)(pi)次(ci)(ci)的白(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)表達(da)基線不同(tong)(tong)，對(dui)暴露于 APAP 的敏(min)感(gan)(gan)性也不同(tong)(tong)。圖1-A 和 1-D 的白(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)起始濃度較(jiao)高，而(er) 1-B 和 1-C 的白(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)起始濃度較(jiao)低(di)(di)。批(pi)(pi)次(ci)(ci) 1（1-A）對(dui)接觸 APAP 最(zui)敏(min)感(gan)(gan)，因(yin)為(wei)低(di)(di)劑量最(zui)終會產(chan)生(sheng)毒性，而(er)批(pi)(pi)次(ci)(ci) 3（1-C）在實驗期(qi)間最(zui)難(nan)存活。每(mei)個(ge)批(pi)(pi)次(ci)(ci) 2-3 個(ge)實驗，每(mei)個(ge)實驗每(mei)個(ge)條件 N=1-5 個(ge)。(*)= P<0.05
2、特定捐獻者的檢測結果可能會影響對毒性反應效果的解釋
圖2
各(ge)供(gong)體(ti)的(de) ALT（而(er)非 LDH）持續升高(gao)。批(pi)(pi)次(ci) 1 的(de) LDH（2-A）和 ALT（2-B）均顯(xian)示細(xi)(xi)胞(bao)大量死(si)亡。然而(er)，批(pi)(pi)次(ci) 2 的(de) LDH（2-C）未(wei)顯(xian)示出明顯(xian)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)死(si)亡，但 ALT（2-D）卻顯(xian)示出細(xi)(xi)胞(bao)死(si)亡。總體(ti)而(er)言，第 2 批(pi)(pi)（2-C 和 D）的(de)起始細(xi)(xi)胞(bao)死(si)亡率確實(shi)(shi)高(gao)于第 1 批(pi)(pi)（2-A 和 B），這表(biao)明細(xi)(xi)胞(bao)存活率存在批(pi)(pi)次(ci)差異。每個(ge)批(pi)(pi)次(ci) 2-3 個(ge)實(shi)(shi)驗，每個(ge)實(shi)(shi)驗每個(ge)條件 N=1-5 個(ge)。(*)= P<0.05
3、平均個體供體結果(guo)可能(neng)會捕捉到(dao)大的(de)效應(ying)，而較小的(de)變化可能(neng)無(wu)法被檢測到(dao)
圖3
四(si)個(ge)單一(yi)(yi)供(gong)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)平均數據顯示(shi)(shi)在(zai)(zai)(zai)高(gao)劑(ji)量下(xia)有毒性，但在(zai)(zai)(zai)低(di)劑(ji)量下(xia)失去了一(yi)(yi)些(xie)批(pi)次(ci)所(suo)見的(de)(de)(de)敏(min)感(gan)性。所(suo)有個(ge)體(ti)(ti)供(gong)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)標準化白蛋白在(zai)(zai)(zai)最高(gao)濃度(du)下(xia)顯示(shi)(shi)出毒性（3-A），但在(zai)(zai)(zai)低(di)劑(ji)量下(xia)未能檢測到(dao)批(pi)次(ci)1（1-A）所(suo)示(shi)(shi)的(de)(de)(de)毒性。尿(niao)素（3-B）在(zai)(zai)(zai)最高(gao)的(de)(de)(de)APAP劑(ji)量下(xia)顯示(shi)(shi)出降(jiang)低(di)，但由于批(pi)次(ci)效(xiao)應差異，在(zai)(zai)(zai)最后(hou)一(yi)(yi)天并(bing)未顯示(shi)(shi)出降(jiang)低(di)。LDH（3-C）由于LDH釋放的(de)(de)(de)批(pi)次(ci)差異，并(bing)未在(zai)(zai)(zai)最高(gao)的(de)(de)(de)APAP劑(ji)量下(xia)顯示(shi)(shi)出增(zeng)加。盡管批(pi)次(ci)之(zhi)間(jian)存(cun)在(zai)(zai)(zai)變異，但ALT（3-D）在(zai)(zai)(zai)合(he)并(bing)批(pi)次(ci)中強烈增(zeng)加。（合(he)并(bing)4個(ge)單一(yi)(yi)供(gong)體(ti)(ti)批(pi)次(ci)，每(mei)個(ge)批(pi)次(ci)進行(xing)2-3次(ci)實驗(yan)，每(mei)個(ge)實驗(yan)每(mei)種條件使用1-5個(ge)芯片。N=23-29。）(*)=p<0.05
4、混合肝細胞（5 供體(ti)混合）沒有表達高水平的白(bai)蛋(dan)白(bai)
圖(tu)4
混合(he)供體顯示出非常(chang)低的白蛋(dan)白產(chan)量，少于1 μg/d/million cells，仍然觀察到劑(ji)量反(fan)應。（2次實驗(yan)，每(mei)次實驗(yan)每(mei)種條件使用1-2個(ge)芯片，總計N=3-4。）(*)= p<0.05
5、芯片間(jian)（Chip-Chip）和(he)實(shi)驗間(jian)（Exp-Exp）的變異性(xing)在(zai)(zai)批(pi)次內是相(xiang)似(si)的，但(dan)在(zai)(zai)不同(tong)批(pi)次之間(jian)存在(zai)(zai)差(cha)異
表格(ge)1
表格1：變(bian)異性是通過計算(suan)所有天(tian)數中對(dui)照組(zu)（Chip-Chip，Exp-Exp）的(de)平(ping)均標準偏差來計算(suan)的(de)。Chip-Chip表示(shi)實(shi)(shi)驗(yan)內芯片之(zhi)間的(de)變(bian)異性，Exp-Exp表示(shi)不同實(shi)(shi)驗(yan)之(zhi)間芯片之(zhi)間的(de)變(bian)異性。
6、敏感性和特(te)異性也取決于批(pi)次和檢測方法
表格2
表格2：敏感性是表現出積極效應(ying)（與對照(zhao)相比(bi)變化(hua)在(zai)+/- 50%以內）的(de)芯(xin)(xin)片(pian)的(de)百(bai)分比(bi)，特異(yi)性是在(zai)平均對照(zhao)的(de)50%以內的(de)芯(xin)(xin)片(pian)的(de)百(bai)分比(bi)。某些批(pi)次和(he)(he)檢測方法(fa)比(bi)其他批(pi)次和(he)(he)方法(fa)更敏感。C=對照(zhao)，L=低APAP，M=中APAP，H=高APAP。
7、功效和樣本量因批(pi)次(ci)而異(yi)
表格3
表格3：我(wo)們根據(ju)(ju)對(dui)照組的(de)(de)平均標(biao)準差進行了統計功效(xiao)分析(xi)和樣本(ben)大小計算，以便(bian)在 90% 的(de)(de)功效(xiao)和 5% 的(de)(de) I 類錯(cuo)誤(wu)率條(tiao)件下檢(jian)測出與(yu)對(dui)照組相(xiang)比 +/-50% 的(de)(de)變化(hua)。因此，功效(xiao)表示生成數據(ju)(ju)的(de)(de)強度，而(er)樣本(ben)量(liang)則是檢(jian)測到與(yu)對(dui)照值相(xiang)比+/-50%的(de)(de)變化(hua)所需的(de)(de)芯片數量(liang)。
結論
1.終(zhong)點基線(xian)水平的變異(yi)性(xing)以及對毒性(xing)藥物的敏(min)感性(xing)可能會使結果的合(he)并和解釋變得(de)困難：
? 批次1 顯示低(di)APAP時白(bai)蛋白(bai)減少，如果(guo)合并數據則會(hui)被(bei)忽略。
? 批次1 是否(fou)對APAP更(geng)敏(min)感？合并批次是否(fou)會導致(zhi)對敏(min)感群體的潛在影響？
2.某些測定在不同批次間的一致性更高。
? ALT 在各批(pi)次(ci)之間的可靠(kao)性較高，而LDH似乎在某些批(pi)次(ci)中表(biao)現良好(hao)，但在其(qi)他批(pi)次(ci)中表(biao)現不(bu)佳。
? 尿素相(xiang)對(dui)于(yu)白蛋白，對(dui)于(yu)細胞功(gong)能來(lai)說是一(yi)個不太敏感的標(biao)志物。
3.變異性、靈敏度、特異性和功效分析似乎都是由個體供體細胞特性（附著能力、對有毒成分的反應、基線生物標志物水平）的結果而變化的。
4.目前尚不清楚為什么有些批次/供體表現比其他批次/供體好或差，但在設計MPS系統中的毒性研究時，應考慮年齡、性別、種族和生活暴露等因素，以代表人口的大部分。需要進一步研究，以探討個體供體、平均個體或混合供體是否更準確地預測大規模人群的毒性。
【推薦閱讀】
主要參考文獻
Kostrzewski T, Cornforth T, Snow S. et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. Jan 2017.
