發布時間：2025/03/20 點擊數：1133 
細(xi)胞治療因其具體獨特的(de)(de)(de)靶(ba)向作用和長期療效(xiao)，成(cheng)為(wei)新藥研發(fa)的(de)(de)(de)熱點。隨著細(xi)胞療法(fa)逐漸步入臨床試驗，細(xi)胞培(pei)養尤(you)為(wei)重要，從而對細(xi)胞培(pei)養基(ji)補充劑的(de)(de)(de)需(xu)求也越來(lai)越大。胎牛血清(qing)（FBS）一(yi)直以來(lai)被作為(wei)是(shi)細(xi)胞培(pei)養的(de)(de)(de)常用補充劑，遺憾的(de)(de)(de)是(shi)涉及倫(lun)理(li)和安全問題。如今，從加工過的(de)(de)(de)血液中提取(qu)的(de)(de)(de)人源(yuan)培(pei)養基(ji)補充劑已經(jing)得到(dao)越來(lai)越多的(de)(de)(de)使(shi)用。人血小(xiao)板(ban)裂解(jie)液（hPL）是(shi)可(ke)用于臨床和商(shang)業化制備細(xi)胞治療產品的(de)(de)(de)補充劑之一(yi)。hPL來(lai)源(yuan)于混合人的(de)(de)(de)血小(xiao)板(ban)，經(jing)連續反復多次的(de)(de)(de)凍融裂解(jie)獲得，其含有的(de)(de)(de)生長因子和細(xi)胞因子與胎牛血清(qing)（FBS）和人AB血清(qing)相同且(qie)含量相當。
另一方面，細胞治療的人原代細胞體外培養及擴增并非易事，國家食品藥品監督管理總局組織制定的《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》中有明確指出：“細胞培養過程中，應盡量避免使用動物來源的物質，比如應盡量避免血清的使用，若必須使用血清，需要提供相關的研究資料說明使用的必要性和合理性；嚴禁使用疫病流行區來源的動物血清；不得使用未經過安全性驗證的血清”。
因此，探索更(geng)加安全、成分(fen)更(geng)加明確的血清替代物對(dui)于細(xi)胞治療(liao)產(chan)品的穩定持(chi)續(xu)生產(chan)至關重(zhong)要。
01 E-beam原理和傳統γ-輻照技(ji)術
一(yi)般(ban)而言，血小(xiao)板（hPL的(de)(de)(de)制作原材料(liao)）相關的(de)(de)(de)篩(shai)查(cha)和測(ce)試標準是(shi)與輸血前(qian)血液(ye)篩(shai)查(cha)相同(tong)。我們知道，傳染(ran)(ran)性(xing)(xing)病原體（特別是(shi)人(ren)類(lei)傳染(ran)(ran)病病毒）的(de)(de)(de)傳播是(shi)人(ren)類(lei)血小(xiao)板衍生產品（如hPL）的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)考慮因素，且多(duo)個(ge)供體的(de)(de)(de)混合血小(xiao)板裂解液(ye)雖可提高(gao)hPL批間一(yi)致性(xing)(xing)和性(xing)(xing)能，但同(tong)時增加了病毒污(wu)染(ran)(ran)的(de)(de)(de)風險。
通(tong)常，醫療(liao)和(he)食品(pin)通(tong)過電子束（E-beam）或(huo)γ射(she)線輻照滅(mie)殺(sha)病毒(du)。有(you)研(yan)究表明，通(tong)過γ照射(she)hPL能有(you)效地(di)滅(mie)活病毒(du)，但會造成hPL的(de)部分生長因子喪失(shi)、不(bu)良的(de)產物(wu)特性（如渾濁現象），以及細胞(bao)擴增效能降(jiang)低的(de)影響(xiang)。因此，通(tong)常還需通(tong)過添(tian)加蛋白質穩定劑等(deng)額(e)外的(de)步驟來減(jian)輕(qing)不(bu)良影響(xiang)，但又可能會引入(ru)新的(de)風險問題。
圖1 Sexton品牌病(bing)原體減少PR工藝(yi)設計(ji)流(liu)程
與傳統的γ輻射方式不同，美國Sexton公司生產了一種pathogen-reduced病原體減少的hPL (PR hPL)，采用電子束照射（E-beam）的過程來降低病毒傳播的風險。E-beam原理：通過電子束直接作用，電子束激發水分子產生羥基自由基、還原性水合電子等活性粒子的氧化-還原的間接作用，對包括病毒等微生物體內的DNA或RNA分子以及蛋白質包膜產生破壞，進而達到病毒減少工藝的作用效果。
美國Sexton PR系列產品(pin)，依照國際(ji)人用藥品(pin)注(zhu)冊技術協調會(hui)ICH/295/95和(he)世衛組織WHO相(xiang)關附(fu)件被用作設計病(bing)(bing)毒(du)(du)清除(chu)驗(yan)(yan)證的指南，建立待驗(yan)(yan)證工(gong)藝的縮小模型(xing)，將工(gong)廠生(sheng)產的nLiven PR，運(yun)送到測試(shi)實驗(yan)(yan)室，在待驗(yan)(yan)證樣品(pin)中人為地加入一定種類和(he)數量的病(bing)(bing)毒(du)(du)（針對血漿來源常規的代表(biao)性(xing)模型(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)）。然后產品(pin)進行(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)去除(chu)/滅活工(gong)藝步驟(zou)，處(chu)理，并返回到測試(shi)實驗(yan)(yan)室進行(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)減少驗(yan)(yan)證分(fen)析。
圖2 Sexton品(pin)牌病原體減(jian)少PR工藝設計流程
通過對經PR工(gong)藝處(chu)理(li)的(de)(de)(de)Sexton PR系列hPL產品進行生(sheng)長因子(zi)(zi)水(shui)平和(he)(he)病毒(du)(du)測試(shi)（流程見圖2：左圖是(shi)E-beam處(chu)理(li)hPL后的(de)(de)(de)生(sheng)長因子(zi)(zi)分析和(he)(he)細胞(bao)擴增實驗(yan)，右圖是(shi)E-beam處(chu)理(li)hPL后的(de)(de)(de)病毒(du)(du)分析），可(ke)證明PR工(gong)藝可(ke)以實現在不顯著影(ying)響hPL組成和(he)(he)hPL功能(neng)的(de)(de)(de)情況下(xia)，實現病原體減少，發揮良(liang)好(hao)的(de)(de)(de)細胞(bao)培養補充物性能(neng)。
02 實驗部分(fen)
1. 細胞因子水平驗證
針(zhen)對以下的常見hPL中的細(xi)胞因子(zi)(zi)，使(shi)用(yong)(yong)ELISA法對普(pu)通hPL（藍色）和(he)電子(zi)(zi)束輻照的nLiven PR（紅色），分別進行(xing)3組(zu)重(zhong)復分析求取平均值，用(yong)(yong)以評價PR工藝對hPL產品細(xi)胞因子(zi)(zi)含量的影響。
圖3 PR工藝的hPL中FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比較
實(shi)驗發現(xian)：除了3A圖中的(de)FGF水平，其他細胞因子(zi)（如3B圖中的(de)EGF、3C圖中的(de)PDGF-AB、3D圖中的(de)TGF-β以及3E圖中的(de)PDGF-BB）在(zai)通(tong)過(guo)電子(zi)束照射（E-beam）的(de)PR工藝獲得的(de)hPL中的(de)含量(liang)與(yu)普通(tong)hPL對比(bi)是相對偏高的(de)。
2. 細(xi)胞擴增生(sheng)長(chang)驗證(zheng)
實驗人員以BM-MSCs培(pei)養實驗為例來驗證PR工(gong)藝hPL的產品性(xing)能。
圖4 PR工藝的hPL與其(qi)他補(bu)充劑的細胞(bao)擴增數(shu)目與形態比較
將BM-MSCs以(yi)2X10*4個細胞/孔的(de)密度接種(zhong)在12孔板(ban)中(zhong)，培養4~5天，收獲(huo)后計數。比較在含有(you)hPL、PR hPL和γ-輻照(zhao)FBS的(de)培養基中(zhong)培養的(de)BM-MSCs的(de)細胞增殖率。
BM-MSCs相對(dui)細胞擴增數結(jie)果比較(jiao)：Sexton品牌的(de)(de)Stemulate產(chan)品和(he)PR工藝的(de)(de)nLiven PR產(chan)品相對(dui)于γ-輻照(zhao)(zhao)的(de)(de)FBS組獲得更多的(de)(de)細胞擴增數目(mu)。BM-MSCs細胞形態比較(jiao)：Sexton品牌的(de)(de)兩款hPL相對(dui)于γ-輻照(zhao)(zhao)的(de)(de)FBS細胞生(sheng)長更為致(zhi)密和(he)均(jun)一。
3. 病(bing)原體減少(shao)工藝的(de)驗證
使用(yong)牛病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)性腹瀉病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)（BVDV）進行標準(zhun)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)空斑試(shi)驗，用(yong)以評估(gu)生產工藝去(qu)除/滅活病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的能力(li)，進行相(xiang)關(guan)病(bing)(bing)(bing)原(yuan)體減少(shao)/去(qu)除效果(guo)的驗證(zheng)。主(zhu)要在應(ying)用(yong)電(dian)子束處(chu)理病(bing)(bing)(bing)原(yuan)體步驟之(zhi)前，將BVDV刺突(tu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)引入樣(yang)品，然后對(dui)經電(dian)子束處(chu)理過的樣(yang)本進行殘留病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)分析。如下圖表中所示PR工藝的hPL的顯(xian)示模型包膜病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)BVDV減少(shao)了6個對(dui)數值。
圖表(biao) 病原體減少結果
4. 其他PR工(gong)藝的(de)hPL生化指標
圖5 PR工藝的hPL關于滲透(tou)壓、pH以及(ji)總(zong)蛋白(bai)的批間(jian)一(yi)致性數據(ju)展(zhan)示
結果顯示：美國Sexton品牌的nLiven PR血小板裂解液使用E-Beam進行病原體處理的產品關于滲透壓、pH以及總蛋白的32個批次的一致性數據展示，可見CV值小于10%，展現了nLiven PR產品良好的批次間一致性。
03 文(wen)末結論
通過實驗驗證，在(zai)Stemulate或nLiven PR中生(sheng)長的BM-MSCs始(shi)終(zhong)顯(xian)示出強勁(jing)的細(xi)胞擴增(zeng)，nLiven PR尤為明顯(xian)。在(zai)其他干細(xi)胞擴增(zeng)實驗中，結果也如(ru)此。
圖(tu)6 Sexton品(pin)牌的nLiven PR、Stemulate以及T-Liven PR產品(pin)
Sexton Biotechnologies的(de)(de)nLiven PR是(shi)(shi)一(yi)種經(jing)過驗(yan)(yan)證(zheng)的(de)(de)、強(qiang)大的(de)(de)病原(yuan)體(ti)減少工藝處(chu)理(li)的(de)(de)產(chan)品，為細(xi)胞(bao)培(pei)養提供一(yi)致的(de)(de)、高質量(liang)的(de)(de)培(pei)養基添(tian)加物。與nLiven PR不同的(de)(de)是(shi)(shi)，Sexton公司的(de)(de)T-Liven PR是(shi)(shi)PR處(chu)理(li)的(de)(de)血小板裂解液的(de)(de)封(feng)閉袋裝系統(tong)版本(ben)，包括T細(xi)胞(bao)生長(chang)驗(yan)(yan)證(zheng)試驗(yan)(yan)的(de)(de)放行測試，確保免疫細(xi)胞(bao)培(pei)養過程(cheng)中的(de)(de)細(xi)胞(bao)質量(liang)。
有趣的(de)是，T-Liven PR在被(bei)(bei)應(ying)用于T細胞(bao)等(deng)免(mian)疫細胞(bao)相(xiang)關(guan)治療時，對于CAR轉導(dao)T細胞(bao)的(de)表型也(ye)被(bei)(bei)發現(xian)具有顯著的(de)優勢。(Torres-Chavez等(deng)人2019年，請聯系(xi)曼(man)博生物獲取相(xiang)關(guan)文(wen)獻資料)
