發布時間：2025/02/24 點擊數：482 一則短訊
經過修訂的“FDA現代化法案3.0”，于2024年12月12日以全票通過的結果獲美國參議院批準（下圖）。美國立法者非常重視推動FDA實施FDA現代化法案2.0（FDAMA 2.0）的任務，這項于2022年12月成為法律的關鍵生物醫學改革，取消了在藥物研發中強制使用人工動物模型的要求，只要可以通過更先行、更具預測性的建模方法（如基于類器官和器官芯片培養的體外模型）來評估藥物在人類中的安全性和有效性。通過采用技術驅動的、與人類高度相關的材料和方法來進行藥物研發和醫療發現，同時避免使用不可靠且具有誤導性的動物試驗，將徹底改變當前浪費嚴重的藥物開發模式。
圖：美國參議院通過FDA現代化法案 3.0[*]
使用Qkine無動物源生長因子進行（類）肝（Hepatocyte-like ）細胞分化
本文概要
iPSC 衍生的肝(gan)細胞分(fen)化的進展凸(tu)顯(xian)了將(jiang)干細胞技術與分(fen)子生物學相結合(he)的潛力(li)，從而為肝(gan)臟(zang)相關(guan)疾病的研究、藥物發現和再生療法帶(dai)來變革。
本文定義了由ipsc生成（類）肝細胞（Hepatocyte-like cell,HLC）的方案和關鍵注意事項，強調了特定生長因子在實現理想的分化結果中的作用。對于從iPSC 分化出 HLC，本應用說明使用了重組激活素A (Qk001)、BMP-4(Qk038)、FGF2-G3(Qk053)、HGF NK1(Qk013)和OSM (Qk049)。
01 簡介
自2006年誘導多能干細胞（iPSCs）問世以來，它們在研究和治療開發中引發了一場革命。iPSCs因其能夠分化為幾乎任何細胞類型的獨特特性，成為疾病建模中不可或缺的工具。這一特性使其在研究遺傳疾病、感染和癌癥方面具有強大的優勢。此外，iPSCs在高通量藥物篩選和毒性研究中的應用明顯推進了我們對多種疾病機制的理解，并支持基于個體遺傳特征定制治療策略[1]。同時，iPSCs作為胚胎干細胞的倫理且可持續的替代方案，進一步拓寬了其在研究和再生醫學中的應用范圍。
iPSCs的一個關鍵應用是肝細胞分化，這是再生醫學中的重要領域。從iPSCs分化得到的（類）肝細胞（HLCs）展現了許多與原代肝細胞相似的功能。這一進步為肝病研究和個性化治療方案的開發帶來了希望，并可能通過提供一種用于治療的新細胞來源，緩解對肝移植的需求[2]。此外，HLCs還是研究肝臟代謝、遺傳性肝病和藥物相互作用的強大模型，在臨床試驗之前評估藥物安全性和肝臟特異性毒性方面具有重要價值。
從iPSCs產生功能性肝細胞需要激活關鍵信號通路，例如Wnt、activin/nodal、FGF和BMP，以模擬肝臟發育的各個階段。通過這些信號通路的依次激活支持早期肝細胞的分化，而成熟過程則依賴于肝細胞生長因子（HGF）和瘤抑素M（OSM）等因子[3]。這種對肝臟發育的模擬是獲得完全功能性HLCs的關鍵，這不僅提升了它們在研究肝病進展中的效用，還改善了藥物篩選和基因編輯技術的治療應用。iPSCs來源的肝細胞分化技術的進步，彰顯了將前端干細胞技術與分子生物學相結合的潛力，從而革新針對肝臟相關疾病的研究、藥物發現和再生療法。
這份應用說明定義了一種生成HLCs的實驗方案及其關鍵注意事項，并重點介紹了特定生長因子在實現理想分化效果中的作用。
02 材料和方法
1. 細胞培養和維護
iPSCs每周傳代兩次，使用0.5 mM EDTA進行細胞消化，并以1:6的分裂比例接種于涂有Vitronectin（Qk120，5 μg/ml）的6孔板中。細胞培養在E8類似培養基中進行，傳代后的次日更換為5 ml新鮮的E8類似培養基，以實現weekend-free media change（無需周末更換培養基）的培養流程。有關此過程的更多詳細信息，請參閱我們關于，該指南特別介紹了使用Qkine的耐熱型FGF-2（bFGF）（Qk053）、無動物源的TGF-β1（Qk010）以及Vitronectin（Qk120）的方案，以提升細胞群體的均一性。
2. iPSCs分化為（類）肝細胞
（類）肝分化(hua)流程圖（圖1）概述了將(jiang)iPSCs分化(hua)為（類）肝細胞的具(ju)體步驟，并通過肝細胞特異(yi)性(xing)標志(zhi)物的表達來評估(gu)分化(hua)效(xiao)果。
圖1.（類）肝(gan)分(fen)化與評估的(de)時間表
第0天
使用 Accutase 將iPSCs從培養(yang)(yang)(yang)基中分離(li)，并以(yi)每孔(kong)150,000個細(xi)胞的(de)(de)密度接種于涂(tu)有Vitronectin（Qk120，5 μg/ml）的(de)(de)6孔(kong)板中，培養(yang)(yang)(yang)基為(wei)添加ROCK抑(yi)制劑（Y-27632，10 μM）的(de)(de)E8類似培養(yang)(yang)(yang)基。次(ci)日（第1天）以(yi)及(ji)每天直至第5天，細(xi)胞使用內胚層培養(yang)(yang)(yang)基（表1）進行培養(yang)(yang)(yang)。
表1. 內胚(pei)層培養基(ji)。在使用前無菌(jun)添加各成(cheng)分
第5天
使(shi)用Accutase將內(nei)胚(pei)層細(xi)(xi)胞(bao)從培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)分離，并以每孔(kong)150,000個細(xi)(xi)胞(bao)的密度接種于涂有Matrigel（0.25 μg/ml）的6孔(kong)板中(zhong)，培(pei)養(yang)基(ji)為添加(jia)ROCK抑制劑（Y-27632，10 μM）的肝細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)胚(pei)層培(pei)養(yang)基(ji)。次日（第6天(tian)(tian)）以及每天(tian)(tian)直至第10天(tian)(tian)，細(xi)(xi)胞(bao)使(shi)用肝細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)胚(pei)層培(pei)養(yang)基(ji)（表(biao)2）進(jin)行培(pei)養(yang)。
表(biao)2. 肝(gan)細胞內胚層培養基。在使用前無菌添(tian)加各成分
第11天
使用Accutase將肝細(xi)胞(bao)(bao)內胚層細(xi)胞(bao)(bao)從培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)分離，收(shou)集在肝酶分化(hua)(hua)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)（表3）中(zhong)，并(bing)以每孔500,000個細(xi)胞(bao)(bao)的密度接種于涂有Matrigel（0.25 μg/ml）的6孔板中(zhong)。培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)為添加(jia)ROCK抑制劑（Y-27632，10 μM）和HGF的肝前體分化(hua)(hua)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)（表4）。次日（第(di)12天(tian)）以及(ji)每天(tian)直至第(di)15天(tian)，細(xi)胞(bao)(bao)使用添加(jia)HGF NK1的肝酶分化(hua)(hua)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)（表4）進行培(pei)(pei)養(yang)。
表3. 肝酶分化培養基(ji)。在使(shi)用前無菌(jun)添(tian)加(jia)各成分
表4. 肝前體分化培養基。在使用前無(wu)菌添(tian)加各成分
第16天
從第16天到第20天，每天更換培養(yang)基，使用1 ml添加了10 μg/ml瘤抑(yi)素M（OSM）的肝細胞分化培養(yang)基（表(biao)5）。
表5. 含OSM的(de)肝細(xi)胞分(fen)化培養基。在(zai)使用前無(wu)菌添加各成分(fen)
3. 免疫細胞化學
在第21天，用(yong)4%多聚甲醛固定細胞，然后使用(yong)稀釋于(yu)0.1% Triton X-100中(zhong)的10%驢血清進行封閉和(he)透(tou)化(hua)。針對肝細胞標志物的特異(yi)性抗體(ti)（如抗白(bai)蛋白(bai)抗體(ti)、抗α1抗胰蛋白(bai)酶(mei)抗體(ti)或抗α1胎蛋白(bai)抗體(ti)）被用(yong)于(yu)免疫染色，在4 °C下(xia)孵育過(guo)夜(ye)。隨后對細胞進行清洗，并用(yong)二級抗體(ti)（Goat anti-Rabbit IgG H&L AlexaFluor 488 and Hoechst 33258）染色，再在磷(lin)酸(suan)鹽緩沖液中(zhong)進行成像（圖2）。
圖2. 分化(hua)后(hou)的iPSCs中肝細(xi)胞標志物的免疫細(xi)胞化(hua)學分析
白(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)[綠色(se)(se)(se)，A]、Hoechst 33258[藍色(se)(se)(se)，B]、白(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)與Hoechst結(jie)合(he)[C]、α1胎蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)[綠色(se)(se)(se)，D]、Hoechst 33258[藍色(se)(se)(se)，E]、α1胎蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)與Hoechst結(jie)合(he)[F]、α1抗胰蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶[綠色(se)(se)(se)，G]、Hoechst 33258[藍色(se)(se)(se)，H]、α1抗胰蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶與Hoechst結(jie)合(he)[I]。圖(tu)像使用EVOS M5000系(xi)統獲(huo)取（比例尺(chi)=150 μm）。
03 結果與結論
iPSCs在(zai)臨床和研究(jiu)應用中的(de)日(ri)益重(zhong)要性源于(yu)其獨特的(de)能力，即可以(yi)分化為人體內所有體細(xi)胞類(lei)型。成功(gong)將iPSCs分化為目標細(xi)胞類(lei)型（如類(lei)肝細(xi)胞）的(de)關(guan)鍵在(zai)于(yu)，在(zai)培(pei)養過程中保持其多能性并實現均一(yi)的(de)分化。使用含有高純度且具(ju)生物活(huo)性的(de)生長因子(zi)的(de)優化培(pei)養基，對于(yu)實現效率高、質量(liang)高的(de)分化并保證實驗的(de)可重(zhong)復性十分重(zhong)要。
本文中展示的數據表明，Qkine提供的高純度生長因子，包括Activin A（Qk001）、FGF2-G3（Qk053）、BMP-4（Qk038）、HGF NK1（Qk013）和OSM（Qk049），能夠有效支持iPSCs向（類）肝細胞的分化。這些生長因子不僅能確保穩定且可靠的分化，還能減少實驗變異性，這是研究和治療應用中的關鍵需求。
該研究強(qiang)調了高質量試劑在(zai)克服iPSCs分化相(xiang)關挑戰（如細(xi)胞性能不一致或結果差異）中(zhong)的(de)重要性。通(tong)過使用Qkine提(ti)(ti)供的(de)無動物(wu)源生長(chang)(chang)因子產品組合，研究人員可以提(ti)(ti)高長(chang)(chang)期復雜細(xi)胞培養的(de)可重復性，并(bing)推動再生醫學(xue)、藥物(wu)開(kai)發和疾病(bing)建模領域的(de)應用發展。
QKine，總部位于英國劍橋，是一家通過 ISO9001:2015 認證的公司。作為蛋白質創新的指引者，產品范圍涵蓋了多個應用領域，旨在提高您研究的可重復性。QKine積極支持并創新于新興領域，如類器官和器官芯片、細胞農業、再生醫學、合成水凝膠和生物打印等。
參考文獻
[1] Yu Y., Wang X. and Nyberg S.L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Cell Med. 2014 Apr 22;7(1):1-13. doi: 10.3727/215517914X680056.
[2] Mallanna S.K. and Duncan S.A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2013 Sep 20;26:1G.4.1-1G.4.13. doi: 10.1002/9780470151808.sc01g04s26.
[3] Luo, Q., Wang, N., Que, H., Mai, E., Hu, Y., Tan, R., Gu, J. and Gong, P. Pluripotent Stem Cell-Derived Hepatocyte-like Cells: Induction Methods and Applications. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 11592. //doi.org/10.3390/ijms241411592
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