細(xi)胞(bao)轉染(ran)(ran)技術在基因治療(liao)和細(xi)胞(bao)治療(liao)開(kai)發中扮演著重(zhong)要(yao)角(jiao)色。為了提高轉染(ran)(ran)效率和病毒(du)包裝產量，研(yan)究者們需要(yao)對轉染(ran)(ran)工(gong)藝中的多個(ge)參(can)數進行優(you)化。本文將綜合探討細(xi)胞(bao)轉染(ran)(ran)優(you)化的關(guan)鍵方向，并提供實用的實踐指南。

一、引言

核(he)酸(suan)遞送是生物學研(yan)究(jiu)、轉基(ji)因和基(ji)因治(zhi)療的(de)(de)重(zhong)要環節。由(you)于(yu)核(he)酸(suan)酶(mei)的(de)(de)普遍存在和核(he)酸(suan)的(de)(de)高(gao)分(fen)子量(liang)特性，外源(yuan)核(he)酸(suan)很難獨立進入靶細胞(bao)，且易被溶酶(mei)體(ti)降解(jie)。因此(ci)，開發有效(xiao)(xiao)的(de)(de)核(he)酸(suan)運載體(ti)是關鍵。聚乙(yi)烯亞胺（PEI）作為一種核(he)酸(suan)運載體(ti)，已(yi)被應用于(yu)細胞(bao)轉染(ran)(ran)。然而(er)，轉染(ran)(ran)效(xiao)(xiao)率受到多種因素的(de)(de)影響(xiang)，優化這些條(tiao)件對于(yu)提高(gao)實驗成功率十(shi)分(fen)重(zhong)要。

二、細胞(bao)轉染優化的關鍵(jian)方向

1、

細胞(bao)培養基是細胞(bao)生長的(de)基礎，其(qi)成分(fen)直接(jie)影(ying)響(xiang)細胞(bao)的(de)活力和轉(zhuan)染(ran)效率(lv)。無血清培養基在轉(zhuan)染(ran)過程中具有(you)較(jiao)大優勢，能(neng)夠支(zhi)持高(gao)密度細胞(bao)生長且不影(ying)響(xiang)轉(zhuan)染(ran)效果(guo)。推薦使(shi)用以下培養基：

血(xue)(xue)清(qing)(qing)的質(zhi)量和用量也需重(zhong)視。建議在無(wu)血(xue)(xue)清(qing)(qing)或低血(xue)(xue)清(qing)(qing)（2%-5%）條件下(xia)進行轉(zhuan)染，以(yi)避免血(xue)(xue)清(qing)(qing)中的蛋(dan)白(bai)因子(zi)干擾質(zhi)粒DNA與PEI的結合。

在(zai)懸浮細胞培(pei)養(yang)中，培(pei)養(yang)體(ti)積(ji)對產(chan)量有較大影響。建議在(zai)小(xiao)體(ti)積(ji)模型中進行(xing)條(tiao)件摸(mo)索，選擇合(he)適的培(pei)養(yang)體(ti)積(ji)以(yi)達到(dao)更佳(jia)生產(chan)效果。對于(yu)總(zong)(zong)容(rong)(rong)量小(xiao)于(yu)500ml的搖(yao)(yao)瓶，培(pei)養(yang)總(zong)(zong)體(ti)積(ji)不超(chao)過20%；對于(yu)總(zong)(zong)容(rong)(rong)量大于(yu)500ml的搖(yao)(yao)瓶，培(pei)養(yang)總(zong)(zong)體(ti)積(ji)不超(chao)過30%。

細胞質量是影響(xiang)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)效(xiao)果的(de)重(zhong)要因素。選用(yong)處于(yu)對數(shu)生(sheng)長期、活力高(gao)、代(dai)(dai)次低（30代(dai)(dai)以內）的(de)細胞進行(xing)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)，可獲得更(geng)佳效(xiao)果。細胞匯合(he)度和傳代(dai)(dai)次數(shu)也會(hui)影響(xiang)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)效(xiao)率，建議使用(yong)低代(dai)(dai)次細胞以確保基因型不變。

細(xi)胞密度(du)(du)直接影響細(xi)胞的生(sheng)長速率和代謝。建議(yi)細(xi)胞密度(du)(du)維持在1~2×10^6/ml，也可嘗試高密度(du)(du)（如5×10^6/ml）以優化(hua)轉(zhuan)染效(xiao)果。

高質量的(de)質粒DNA是(shi)成功(gong)的(de)關鍵。質粒純度應滿足(zu)A260/A280值(zhi)在1.8左右，且內毒(du)素需(xu)清(qing)除(chu)干凈。質粒用(yong)量需(xu)根(gen)據細胞數量和轉染(ran)試(shi)劑的(de)要求進(jin)行調整(zheng)，一般(ban)為(wei)1~2μg / 1×10^6細胞。

在病(bing)毒包裝過程中，質粒比例對(dui)轉染效率和(he)病(bing)毒產(chan)量(liang)十分重要(yao)。對(dui)于AAV包裝，初始建(jian)議質粒比例為(wei)Ad plasmid：Rep+Cap plasmid：transfer target gene = 2:1.5:1。

質粒DNA與PEI的比例(li)直接影響(xiang)復合(he)體的穩定(ding)性和轉(zhuan)染效率。建(jian)議從PEI與質粒DNA比例(li)為2:1開始優化(hua)。

孵育(yu)體(ti)(ti)積(ji)影響質粒DNA與PEI復(fu)合體(ti)(ti)的形成和與細(xi)胞的有效接觸。建議孵育(yu)體(ti)(ti)積(ji)維持在總培養體(ti)(ti)積(ji)的5%-10%。

推薦采(cai)用(yong)AB液(ye)的(de)形式，即分別(bie)配置質(zhi)粒(li)DNA溶(rong)(rong)液(ye)和PEI溶(rong)(rong)液(ye)，然后將PEI溶(rong)(rong)液(ye)加入質(zhi)粒(li)DNA溶(rong)(rong)液(ye)中。孵育時間建議控制在(zai)10-20分鐘。

病(bing)(bing)(bing)毒顆粒(li)的(de)收獲(huo)時(shi)(shi)間影響病(bing)(bing)(bing)毒滴度(du)。建議慢病(bing)(bing)(bing)毒在轉染后48小(xiao)時(shi)(shi)收獲(huo)，AAV病(bing)(bing)(bing)毒在轉染后72小(xiao)時(shi)(shi)收獲(huo)。

三、結論(lun)

細胞轉(zhuan)染的成功依賴于對多個參(can)數的嚴格優化(hua)。通過合理選擇培養基、控制培養條件、優化(hua)細胞狀態和轉(zhuan)染試(shi)劑的使(shi)用，可以明(ming)顯提(ti)(ti)高轉(zhuan)染效率和病(bing)毒包裝(zhuang)產量。希望本(ben)文的指南能為研(yan)究者提(ti)(ti)供實用的參(can)考。

四、參考文獻

[1] Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies.

[2] Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector.

[3] Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences.