發布時間：2025/03/27 點擊數：946 評估Caco-2細(xi)胞在吸收、滲透性和生物利用度研究中的金標準地位：其局限性是否(fou)合理？
一則(ze)短訊
經過修(xiu)訂的“FDA現代化法案3.0”，于2024年12月12日以全票通過的結果獲美國參議院批準（下圖）。
美國立法者十分重視推動FDA實施FDA現代化法案2.0（FDAMA 2.0）的任務，這項于2022年12月成為法律的關鍵生物醫學改革，取消了在藥物研發中強制使用人工動物模型的要求，只要可以通過更先進、更具預測性的建模方法（如基于類器官和器官芯片培養的體外模型）來評估藥物在人類中的安全性和有效性。
通過采(cai)用(yong)技術驅動(dong)的、與人類高度相關的材料和方法(fa)來進行藥物(wu)(wu)研(yan)發(fa)和醫療發(fa)現，同時避免使用(yong)不(bu)可(ke)靠且具有誤導(dao)性的動(dong)物(wu)(wu)試驗，將(jiang)徹底改(gai)變當前浪費嚴重的藥物(wu)(wu)開發(fa)模(mo)式。
圖：美國參議院通過FDA現代化法案3.0 [*]
前(qian)言
在藥物研究領域，Caco-2細(xi)胞(bao)長期以來被(bei)譽為(wei)研究腸(chang)道(dao)吸收和通透性的黃金標準。人類上(shang)皮性結(jie)直腸(chang)腺(xian)癌細(xi)胞(bao)因其能夠(gou)分化為(wei)腸(chang)細(xi)胞(bao)樣細(xi)胞(bao)、形成模(mo)仿(fang)腸(chang)道(dao)屏障的緊(jin)密連接而受到重視。
然而，與其(qi)(qi)他(ta)模型系(xi)統一樣，Caco-2細胞也有其(qi)(qi)自(zi)身的(de)局限性。這提出了一個重要的(de)問題：它(ta)們的(de)局限性是否會削(xue)弱其(qi)(qi)黃金標準(zhun)地位？是時候用更符合生理(li)學的(de)方法(fa)改進估計(ji)了嗎？有哪些新(xin)方法(fa)可用，以及它(ta)們的(de)好處是否足以抵消采用新(xin)方法(fa)所(suo)需的(de)努力(li)？
一(yi)、Caco-2細胞的優勢
Caco-2細(xi)胞模型不可否認的(de)優(you)勢和簡便性，充分證明了(le)它(ta)(ta)們為(wei)(wei)何在藥(yao)物開發(fa)中(zhong)長期以來一直是(shi)一種寶貴(gui)的(de)工具。我們常聽到一句話：“如果它(ta)(ta)沒(mei)有壞(huai)，為(wei)(wei)什(shen)么(me)要修理(li)它(ta)(ta)？” 因(yin)此(ci)，推動變(bian)革的(de)創新必須具備較(jiao)大優(you)勢。那么(me)，當Caco-2細(xi)胞以其以下特點而廣(guang)為(wei)(wei)人知時(shi)，變(bian)革的(de)驅(qu)動力(li)是(shi)什(shen)么(me)呢？
1. 預測能力：它們能夠在Transwell插入物上形成緊密連接的單層細胞，從而可靠地預測被動擴散化合物的藥物滲透性。
2. 可重復性：使用Caco-2細胞能夠提供一致且可重復的結果，這對于對比研究和監管申報十分重要。
3. 使用便捷：這些細胞源自人類結腸癌，相對容易培養，因此實驗室可以輕松獲取。
我們認為(wei)，變(bian)革的(de)驅動(dong)力與藥(yao)物(wu)代(dai)謝有關。當(dang)藥(yao)物(wu)通過口服途徑(jing)進(jin)入人體時(shi)，其(qi)在腸道中(zhong)的(de)吸收和滲透僅(jin)(jin)僅(jin)(jin)是旅(lv)程的(de)第一步(bu)。腸道是一個(ge)代(dai)謝活躍的(de)器(qi)官；此外，在口服藥(yao)物(wu)發(fa)揮其(qi)實際(ji)靶效應之前，還需(xu)考慮另(ling)一個(ge)重要器(qi)官——肝臟的(de)影響。
目前，我(wo)們從(cong)Caco-2模(mo)型(xing)中獲(huo)得(de)體外吸收和滲透性數(shu)據(ju)，然(ran)后利用(yong)體外肝臟清(qing)除實(shi)驗(yan)。然(ran)而，這種方法(fa)存在脫(tuo)節，因(yin)為它(ta)未能考慮(lv)藥(yao)物在腸道吸收和代謝(xie)后到達肝臟的(de)藥(yao)代動力學過程(cheng)。因(yin)此，使(shi)用(yong)分離(li)的(de)實(shi)驗(yan)方法(fa)在估算藥(yao)物生物利用(yong)度時會留(liu)下令人(ren)擔憂的(de)認知空(kong)白。
二、為什(shen)么估(gu)算(suan)人類口(kou)服生(sheng)物利(li)用度(du)是臨床前研究中(zhong)的一(yi)項挑戰？
在(zai)(zai)臨床研究(jiu)之前，準確估算(suan)藥物的(de)生物利用(yong)(yong)度對于制定安全且(qie)有效的(de)劑量十(shi)分(fen)重(zhong)要，同(tong)時也(ye)是一項監(jian)管(guan)(guan)要求。從分(fen)離的(de)體外測試中(zhong)獲得的(de)數據可(ke)以用(yong)(yong)來推(tui)斷藥物的(de)生物利用(yong)(yong)度，但這(zhe)種(zhong)方法僅在(zai)(zai)極端情(qing)況下能提(ti)供可(ke)操作的(de)見解。盡管(guan)(guan)這(zhe)些局(ju)限性可(ke)以通過體內動物生物利用(yong)(yong)度研究(jiu)和(he)計算(suan)模型（in silico）在(zai)(zai)一定程度上緩(huan)解，但它(ta)們也(ye)存在(zai)(zai)自身(shen)的(de)不足。
1. 計算模型的局限性：計算模型的預測能力高度依賴于輸入數據的質量。
2. 動物研究的局限性：由于生理和代謝能力的種屬差異，動物研究的預測結果在人類中的可轉化性較低。
Musther等人[1]在2014年開展的一項開創性研究調查了184種化合物，發現常用動物模型的生物利用度數據與人類數據的相關性較低（小鼠R2=0.25，大鼠R2=0.28，狗R2=0.37）。非人靈長類動物（NHP）模型在這方面表現更優，與人類的生物利用度相關性更高（R2=0.69）(下圖)，但由于重大的倫理問題、嚴格的監管要求以及高昂的成本，這些模型并不常用。
圖(tu)：按(an)物(wu)種劃(hua)分(fen)的(de)線性(xing)(xing)回歸分(fen)析圖(tu)（以百分(fen)比表示(shi)）每(mei)個圖(tu)中均顯(xian)示(shi)了線性(xing)(xing)回歸的(de)決定(ding)系數（R2）[1]
因此，臨(lin)床(chuang)前估(gu)算人類口服(fu)生物利用(yong)度是一個復雜(za)的過(guo)程，需(xu)要(yao)整合(he)多個來源的數據(ju)。通過(guo)采(cai)用(yong)更具人類相(xiang)關性的研(yan)(yan)究(jiu)方法改進這(zhe)一過(guo)程，可能成為(wei)快速提升(sheng)研(yan)(yan)究(jiu)效(xiao)率的一大突破點。
三、使用Caco-2細胞在體外模擬首過(guo)代謝過(guo)程
將測量藥物吸收(shou)/滲(shen)透性的(de)(de)金標(biao)準方法(fa)(fa)與測量肝(gan)臟清除率的(de)(de)金標(biao)準方法(fa)(fa)流體連接起來，是提(ti)高(gao)從Caco-2細(xi)胞(bao)實驗中(zhong)獲(huo)得數據(ju)價值的(de)(de)顯而易見的(de)(de)步驟。微流控器(qi)官芯(xin)片(pian)(pian)供應商CN Bio通過開發一(yi)種腸道芯(xin)片(pian)(pian)模型探(tan)索了這一(yi)方法(fa)(fa)。具體來說(shuo)，我們(men)在Transwell插(cha)入物的(de)(de)基(ji)底側培養了一(yi)種混(hun)合細(xi)胞(bao)模型，由腸道上(shang)皮細(xi)胞(bao)（Caco-2）和杯(bei)狀細(xi)胞(bao)（HT29-MTX）組成，同時(shi)暴露于循環培養基(ji)中(zhong)。
我們將Caco-2腸道芯片與經過高度表征和驗證的原代人類肝臟芯片模型流體連接起來，后者已被美國FDA認可（這是Shou個器官芯片供應商與監管機構的合作出版物），其性能優于傳統的靜態肝臟培養方法[2]（Rubiano等，2021）。
通過(guo)將這(zhe)兩種模型流體連接起來形成一(yi)個系統(tong)（下圖），我(wo)們(men)將此前(qian)孤立的(de)實驗整合(he)為一(yi)個整體（使用PhysioMimix多(duo)器官系統(tong)和(he)多(duo)芯片(pian)雙器官板），在(zai)體外模擬(ni)(ni)首過(guo)代(dai)謝(xie)過(guo)程。這(zhe)種方法的(de)優勢在(zai)于(yu)能(neng)夠模擬(ni)(ni)靜脈(mo)和(he)口服(fu)給藥，以(yi)評(ping)估每種模型的(de)單(dan)獨和(he)聯合(he)貢獻，從而推導出曲(qu)線下面積（AUC），即藥物在(zai)腸道吸收和(he)代(dai)謝(xie)后的(de)藥代(dai)動力學(xue)，并估算(suan)到達肝臟的(de)比例，為生物利(li)用度估算(suan)提供缺失的(de)關鍵(jian)信息。
圖：肝(gan)-腸雙器官串(chuan)聯芯片(pian)
這(zhe)種創(chuang)新的腸(chang)/肝芯片模型（也稱為腸(chang)/肝微生理系統，Gut/LiverMPS）的性(xing)(xing)能(neng)已由羅(luo)氏（Roche）公(gong)司(si)使用前(qian)體藥(yao)物霉酚酸酯(zhi)(zhi)(zhi)（mycophenolate mofetil）進行評估[3]（點(dian)擊查(cha)看詳(xiang)情）（Milani等，2022）。然而，羅(luo)氏在其研究(jiu)中指出(chu)，當(dang)處理這(zhe)類藥(yao)物時，Caco-2細胞模型存在一(yi)定(ding)的局限(xian)性(xing)(xing)，主要(yao)是因為羧酸酯(zhi)(zhi)(zhi)酶1和2（CES1和CES2）的表(biao)達。在Caco-2細胞中，這(zhe)些(xie)酶的表(biao)達既不符合生理水平(ping)，也不具有與人體相關(guan)性(xing)(xing)。這(zhe)些(xie)酶對(dui)于酯(zhi)(zhi)(zhi)類前(qian)體藥(yao)物的水解至關(guan)重(zhong)要(yao)，其缺乏可能(neng)影響(xiang)含酯(zhi)(zhi)(zhi)藥(yao)物的代(dai)謝和吸收預測的準確性(xing)(xing)（下圖(tu)）。
圖(tu)：Roche使(shi)用的CN Bio PhysioMimix 肝-腸(chang)MPS展示(shi)
但這(zhe)僅是(shi)Caco-2細胞眾多局限(xian)性(xing)之一，而這(zhe)些局限(xian)性(xing)限(xian)制(zhi)了我們PhysioMimix生物利用度(du)實驗中雙器官模型估算(suan)的準確(que)性(xing)。
四、當兩家微生理(li)系統（MPS）提(ti)供商聯(lian)手(shou)時
2024年1月，CN Bio宣布(bu)與Altis Biosystems建立緊(jin)密的(de)戰略合作(zuo)伙伴關系(xi)。此合作(zuo)使(shi)我們(men)能夠在雙器官(guan)系(xi)統中，用Altis的(de)原代(dai)(dai)人類(lei)RepliGut-Planar空腸(chang)(chang)模(mo)(mo)型替代(dai)(dai)我們(men)原先使(shi)用的(de)灌流(liu)Caco-2腸(chang)(chang)道芯片。RepliGut模(mo)(mo)型利(li)用人類(lei)腸(chang)(chang)道干細胞創建的(de)體外(wai)模(mo)(mo)型更接近人體，如下(xia)圖：
圖：咪達唑(zuo)侖在兩種(zhong)腸(chang)/肝MPS模(mo)型的口(kou)服生物利用度，并與文獻中發(fa)表的人類和動(dong)物數(shu)據進行了比較
RepliGut-Planar空腸模型(xing)克服了(le)Caco-2細胞的額外局限性，包括：
1. 缺乏復雜性：雖然Caco-2細胞能夠模擬腸道屏障，但無法完全再現人類腸道的復雜性。它們缺少腸道內多種細胞類型，這些細胞在吸收和滲透中扮演重要角色。
2. 粘液分泌：Caco-2細胞不分泌粘液，而RepliGut模型包含能夠分泌粘液的杯狀細胞，更好地模擬了體內環境。
3. 屏障完整性：RepliGut模型具有明顯的細胞擴增階段（主要是干細胞和祖細胞）和分化階段（主要是分化細胞）。隨著細胞成熟，其屏障完整性（通過跨上皮電阻TEER監測）逐漸增強，更接近高度再生的人類腸道特性。
4. 外排轉運體的過度表達：Caco-2細胞缺乏關鍵的外排轉運體（如P-糖蛋白），可能導致藥物吸收的低估。而RepliGut模型的基因表達數據顯示，隨著細胞成熟，轉運體的調控更加差異化，使Caco-2更像未成熟細胞。
5. 代謝酶表達：Caco-2細胞的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達有限，可能導致對藥物代謝特征及潛在生物利用度的理解不完整。RepliGut模型表達了更符合生理的代謝酶水平，包括細胞色素P450（CYP）、UGT和CES酶，從而提高了藥物代謝研究的準確性。
這一合作(zuo)使我們邁出了重(zhong)要一步，借助更先進(jin)的(de)(de)人類化腸(chang)道模型，進(jin)一步提(ti)升了雙器官系統在藥(yao)物代(dai)謝和生物利用度研究中的(de)(de)應用潛力。
五、使用原代人類RepliGut/Liver-on-a-chip模型改進體外人類生物利用度的評估能力，與單獨使用Caco-2細胞的對比
研(yan)究(jiu)中(zhong)采(cai)用流體連接的RepliGut-Planar空(kong)腸/肝臟芯(xin)片模型（RepliGut-Planar空(kong)腸/肝臟MPS），測試了兩種(zhong)化合(he)物（temocapril和(he)midazolam），這些化合(he)物的人體ADME特性(xing)未被現有模型準確預測。
1. Midazolam：這(zhe)是一種通過CYP3A4酶在腸道和肝臟清除的藥物(wu)，而Caco-2細(xi)胞(bao)中幾乎不表達CYP3A4。
2. Temocapril：這是一種設計為抗腸道水解的前體(ti)藥物(wu)，通過CES1代謝為temocaprilat。然而(er)，CES1在Caco-2細胞中的表達明(ming)顯高于人體(ti)，導致藥物(wu)清(qing)除率被(bei)高估(gu)。
研究結(jie)果表明(ming)，原(yuan)代雙器官模型(xing)為體外獨特地評估人類生物利用度提供了(le)一種可行的(de)替(ti)代方案，成功(gong)克(ke)服了(le)Caco-2細胞系在人類相關性方面(mian)的(de)局限性。
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結論
盡管Caco-2細(xi)胞存在(zai)局限性，其(qi)使用便(bian)捷性使其(qi)在(zai)初(chu)步篩(shai)選和(he)對(dui)比研究中不可(ke)或缺。然而(er)，關(guan)鍵在(zai)于將Caco-2研究與其(qi)他更(geng)具生(sheng)理相(xiang)關(guan)性的(de)(de)模(mo)型(xing)相(xiang)結合(he)。通過這種方式，可(ke)以全面了解人類腸道和(he)肝臟的(de)(de)聯合(he)作用，從(cong)而(er)更(geng)準確地在(zai)體(ti)外評(ping)估口服藥(yao)物(wu)的(de)(de)生(sheng)物(wu)利(li)用度。
在藥物發現早期生成更具人類相關性的數據，意味著可以在昂貴的臨床前體內研究之前發現并解決潛在問題。由于RepliGut/Liver-on-a-chip模型完全由原代人類細胞組成，無需考慮種屬差異，因此可用于克服動物模型ADME預測與人類結果之間的弱相關性。通過彌合體外實驗與體內研究之間的差距，該模型使研究人員能夠更自信地推進最有前景的藥物候選物，從而降低成本并減少動物使用量。
正因如(ru)此，我們認為變革的(de)益處(chu)遠(yuan)(yuan)遠(yuan)(yuan)超過(guo)維(wei)持現(xian)狀的(de)好(hao)處(chu)，預計通(tong)過(guo)將動態模型(xing)整合(he)到ADME/DMPK研究工(gong)具中，金標準(zhun)將被重新定義(yi)。
因此(ci)，不要拖延解決ADME藥物開發中(zhong)的(de)挑戰！等待的(de)時間越(yue)長，臨(lin)床前估算誤差(cha)導致的(de)問(wen)題(ti)逐步擴大的(de)風險就越(yue)大。
擴展閱讀
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參考文獻
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[3] Application of a gut–liver-on-a-chip device and mechanistic modelling to the quantitative in vitro pharmacokinetic study of mycophenolate mofetil.DOI: 10.1039/D2LC00276K
[*] //animalwellnessaction.org/u-s-senate-passes-fda-modernization-act
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