縮小(xiao)差(cha)距：用于(yu)在藥物(wu)(wu)研(yan)發(fa)過程(cheng)中評估藥物(wu)(wu)性肝(gan)損傷 (DILI) 的人(ren)體和臨床前(qian)動物(wu)(wu)微生理系統

本文來源(yuan)于(yu)CN Bio在2024年(nian)9月8日-11日在丹(dan)麥哥(ge)本哈(ha)根參(can)加“2024歐(ou)洲毒理學會(hui)”的(de)學術海(hai)報（展位#38），可聯系曼博(bo)生物獲取(qu)原資源(yuan)

結(jie)論速覽(lan)

目(mu)前(qian)的(de)(de)(de)(de)體外和體內(nei)模型(xing)無(wu)法準確重現人(ren)類(lei)(lei)肝臟或其對(dui)藥(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)反應(ying)，這導(dao)致了臨床試驗和上市后高藥(yao)(yao)物(wu)淘汰率。正(zheng)如本文數(shu)據所(suo)展示的(de)(de)(de)(de)，由于我們的(de)(de)(de)(de)人(ren)類(lei)(lei)肝臟芯片(pian)模型(xing)在(zai)提(ti)高人(ren)類(lei)(lei)相關性(xing)和預測能力方(fang)面的(de)(de)(de)(de)優勢，其在(zai)早期藥(yao)(yao)物(wu)開發中的(de)(de)(de)(de)應(ying)用將有(you)助于在(zai)研發流程的(de)(de)(de)(de)早期識別潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)(de)肝毒性(xing)化(hua)合(he)物(wu)。此外，動(dong)物(wu)肝臟芯片(pian)的(de)(de)(de)(de)使(shi)用彌合(he)了當前(qian)體內(nei)動(dong)物(wu)數(shu)據和臨床結果之間的(de)(de)(de)(de)差距，并有(you)助于理(li)解物(wu)種差異。

綜合來看，早期使用人類(lei)和動物(wu)器官芯片評估DILI可(ke)以減(jian)少(shao)進(jin)入臨床(chuang)前測試的(de)分子數量(liang)，從(cong)而支持減(jian)少(shao)所需動物(wu)的(de)數量(liang)，進(jin)而有助于(yu)3Rs（替代、減(jian)少(shao)、優化）努(nu)力，降(jiang)低成本(ben)。

引言

藥(yao)物(wu)(wu)性肝損(sun)傷 (DILI) 仍然是全球(qiu)最常見的(de)急性肝功能衰竭原因，也(ye)是藥(yao)物(wu)(wu)研(yan)發(fa)中化合物(wu)(wu)流失的(de)主要(yao)原因。盡(jin)管(guan)目(mu)前用于(yu)藥(yao)物(wu)(wu)研(yan)發(fa)的(de)模(mo)型足以捕捉大多數內(nei)在(zai)事件，但它們存在(zai)局(ju)限性，因為它們無法有效預測或理解人類中更復雜的(de) DILI 事件。此外，由于(yu)遺傳或免疫反應差(cha)異(yi)，細胞系/動物(wu)(wu)模(mo)型不太適合測試新的(de)人類特異(yi)性模(mo)式(shi)。使用 PhysioMimix 器(qi)官芯片 (OOC，也(ye)稱微生理系統 MPS) 系統，已(yi)經開(kai)發(fa)出人類和臨床(chuang)前動物(wu)(wu)微生理系統 (OOC/MPS) 模(mo)型來彌補這些(xie)差(cha)距。

PhysioMimix 多芯片(pian) Liver-12 板包含 12 個用于 OOC/MPS 培(pei)養(yang)的單獨(du)灌注(zhu)芯片(pian)。由(you)于每個肝(gan)(gan)臟微組(zu)織的尺寸相對較大，且(qie)需要從中取樣的培(pei)養(yang)基量較大，因(yin)此該方法可以表征毒性(xing)途(tu)徑(jing)，從而提供機制見解，更(geng)好地為臨床前安全(quan)性(xing)研(yan)究提供信息(xi)。在 Liver-12 板中，將原(yuan)代(dai)人類和(he)動物肝(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)（肝(gan)(gan)細(xi)(xi)胞(bao)和(he)庫普弗細(xi)(xi)胞(bao)）作為 3D 微組(zu)織在支架上灌注(zhu)培(pei)養(yang)兩周(zhou)，并評估其預測臨床前和(he)臨床安全(quan)性(xing)結果的能(neng)力。

材料與方法

從BiolVT公司(si)獲得了冷凍保存的(de)原代人類(lei)肝細(xi)胞(bao)（PHHs），從Lonza公司(si)獲得了人類(lei)枯否細(xi)胞(bao)（HKCs）。PHHs和HKCs以10:1的(de)比例在 PhysioMimix 多(duo)芯片(pian)(pian)Liver-12板中進行共培養(yang)，并在 PhysioMimix 單(dan)器官標(biao)準系統下灌注(zhu)培養(yang)了八天（如圖(tu)1所(suo)示）。類(lei)似地(di)，從BiolVT公司(si)獲得的(de)冷凍保存的(de)原代Sprague-Dawley大鼠肝細(xi)胞(bao)和Beagle犬肝細(xi)胞(bao)在 PhysioMimix 多(duo)芯片(pian)(pian)Liver-12板中使用 PhysioMimix 單(dan)器官標(biao)準系統灌注(zhu)培養(yang)了七天。

圖1 - 用于(yu)毒性測試的肝臟OOC/MPS實驗設置，包括人類(lei)和(he)動(dong)物細胞。

A) 肝(gan)臟OOC/MPS系統的示意圖，包括(kuo)硬(ying)件(jian)（頂部）、Liver-12/-48板(ban)（左側）與肝(gan)臟支架（中間）及流動概(gai)況（右側）。

B) 用于(yu)毒(du)性實驗(yan)(yan)的細(xi)胞(bao)：內部驗(yan)(yan)證的PHH和HKCs（共培(pei)養(yang)）或(huo)原代大(da)鼠和犬的肝細(xi)胞(bao)（單一(yi)培(pei)養(yang)）。

C) 終點檢測用于評估(gu)細胞(bao)健康(kang)（LDH、ATP、ALT、AST、GSH）、細胞(bao)功能性（白(bai)蛋(dan)白(bai)、尿(niao)素、CYP、細胞(bao)因(yin)子(zi)/趨化因(yin)子(zi)）以及未處理(li)和處理(li)過的微(wei)組織的代表性光學顯微(wei)鏡圖像。

在第4天(tian)，肝臟(zang)微組織被給予一(yi)系(xi)列測試化合物，濃度逐漸增加（相當于臨(lin)床前研(yan)究）。測試化合物每48小時(shi)給藥一(yi)次，持續(xu)四(si)天(tian)。載體對(dui)照為(wei)0.1%的DMSO。每種條件均進行了(le)三(san)次重復(fu)測試。

通過(guo)ELISA（R&D systems）測(ce)量(liang)(liang)白蛋白的(de)產生，使(shi)用Cytotox96測(ce)定（Promega）檢(jian)測(ce)LDH釋(shi)放，通過(guo)QuantiChrom試(shi)劑盒（Universal Biologicals）測(ce)量(liang)(liang)尿素合成(cheng)，使(shi)用P450-Glo CYP3A4測(ce)定（Promega）檢(jian)測(ce)CYP3A4活(huo)性(xing)(xing)，使(shi)用丙氨(an)酸轉氨(an)酶活(huo)性(xing)(xing)測(ce)定試(shi)劑盒（Abcam）檢(jian)測(ce)ALT活(huo)性(xing)(xing)，并通過(guo)CellTiter-Glo 3D細胞活(huo)力(li)測(ce)定（Promega）評(ping)估細胞活(huo)力(li)。

結果

1    人(ren)類DILI模(mo)型(xing)(xing)的(de)穩健性通過(guo)在第(di)4天對三個(ge)可溶性質量(liang)控制生物標志物進行評(ping)估(gu)，以確定形成的(de)肝臟(zang)微組織的(de)質量(liang)和功能性（圖2）。LDH、尿素和白(bai)蛋白(bai)的(de)研究內變異系(xi)數（CV）低于15%，研究間變異系(xi)數低于20%（N = 360個(ge)孔(kong)/肝臟(zang)微組織），這證(zheng)明了我們體外人(ren)類肝臟(zang)OOC/MPS模(mo)型(xing)(xing)是預測DILI風險的(de)穩健器(qi)官模(mo)型(xing)(xing)。（下圖）。

圖2 - 人類肝臟OOC/MPS產生高度可重復的數(shu)據和一致的微組織。

第(di)4天的3D肝臟微組織質量控制指標，包括：

A) 活力評估、LDH，及功能性評估

B) 尿素(su)和C)白蛋白（平均值 ÷ 標準差，N = 360）。數據來自(zi)12項獨立實(shi)驗。

在測試了(le)四種已知的(de)(de)肝毒性化合物(wu)（奈法唑酮nefazodone、雙氯芬酸diclofenac、曲格列酮troglitazone和(he)西他(ta)生(sheng)坦sitaxentan）后，人類OOC/MPS模型成(cheng)功地將(jiang)所有化合物(wu)鑒定為(wei)真正的(de)(de)陽性，并顯示出與臨(lin)床中(zhong)(zhong)檢測到的(de)(de)ALT升高相似(si)的(de)(de)結果（表1），從而強調(diao)了(le)該人類肝臟(zang)OOC/MPS模型在臨(lin)床轉化中(zhong)(zhong)的(de)(de)可行(xing)性。

表1 - PhysioMimix 人類DILI OOC/MPS成功預(yu)測了臨(lin)床結果(guo)，顯示出四種化(hua)合(he)物（奈(nai)法(fa)唑酮、雙氯芬酸、西(xi)他生坦、曲格列酮）在DILI臨(lin)床結果(guo)和風險特征方面的ALT升高與臨(lin)床高度(du)相關。

人類(lei)肝(gan)臟微組織暴露于測試物質96小時。ULN = 血清ALT的(de)正常上(shang)限(xian)（來自臨床數據），ULV = 載體對照中ALT水平的(de)上(shang)限(xian)。

*數(shu)據(ju)來源(yuan)于(yu)livertox.nih.gov。

2   在暴露于西他生坦sitaxentan后，大鼠肝臟OOC/MPS未檢測到毒性（圖(tu)3B），這與(yu)臨(lin)(lin)床人類體(ti)內數據一致。另一方面，人類DILI OOC/MPS檢測到西他生坦存在DILI風(feng)險，反映了嚴重(zhong)的敏(min)感性威脅，并與(yu)批準前的臨(lin)(lin)床數據相符(fu)。

圖3 - 人類DILI OOC/MPS模型檢(jian)測到西他生坦為(wei)真(zhen)正的陽性，但動(dong)物DIL OOC/MPS模型未能(neng)檢(jian)測到這一點，這與(yu)臨(lin)床(chuang)前和臨(lin)床(chuang)數據一致。

A) 人類(lei)OOC/MPS檢測到(dao)西他生坦的(de)DILI風險，基于(yu)ALT、LDH、白蛋(dan)白和尿(niao)素的(de)結果(guo)，但在跨物種的(de)肝臟模型中未能捕捉到(dao)這種風險，

B) 包括大(da)鼠（深藍(lan)色(se)）和狗（淺(qian)藍(lan)色(se)）。所有(you)肝(gan)臟(zang)微組(zu)織均暴露于西他生(sheng)坦96小時。顯示的數據為平(ping)均值(zhi) + 標(biao)準(zhun)差（SD）。N=3。

3    經典(dian)的(de)配對化(hua)合物托卡(ka)朋(peng) tolcapone（DILI）和恩(en)他卡(ka)朋(peng)entacapone（無DILI）也(ye)在(zai)一項(xiang)概念(nian)驗證研究中在(zai)臨床前(qian)物種(zhong)OOC/MPS上(shang)進行(xing)了測試(shi)。動物OOC/MPS在(zai)四個終點(dian)上(shang)重(zhong)現了這兩種(zhong)化(hua)合物的(de)上(shang)市后體內數(shu)據（圖4B-C）。人類肝臟OOC/MPS的(de)結果與人類數(shu)據一致，顯示出良好的(de)可轉化(hua)性（圖4A）。

圖4 - 人類和臨床前動物肝臟OOC/MPS預測了恩他卡朋和托卡朋的DILI風險。

A) 人類(lei)肝臟OOC/MPS模型對(dui)托(tuo)卡(ka)朋tolcapone（藍色-DILI）和(he)恩他卡(ka)朋entacapone（黃色-無DILI）與體內臨床(chuang)數(shu)據表現出良(liang)好的可(ke)轉化性(xing)。跨物(wu)種肝臟OOC/MPS模型

B) 大鼠和 C) 狗 - 也與(yu)這些化(hua)合(he)物(wu)的(de)體內臨床前動物(wu)數(shu)據一致。

參考文獻

1. Lisi, D. M. et al. (2016). Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34.

2. Novac, O. et al. (2022) Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro. Journal of Visualized experiments: Jove. (179). DOI: 10.3791/63389. PMID: 3515664

3. Erin M. Gallagher, E. M. (2023) Normalization of organ-on-a-Chip samples for mass spectrometry-based proteomics and metabolomics via Dansylation-based assay. Tox in Vitro (88) 105540. //doi.org/10.1016/j.tiv.2022.105540.

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