Axol×NETRI神經芯片 | 助力NMJ模型升級，推動ALS藥物發現

發布時間：2025/07/24 點擊數：45

摘要：Axol及NETRI神經芯片(pian)助力(li)NMJ模(mo)型升級，推動ALS藥物發現

人(ren)體iPSC神(shen)(shen)經(jing)肌(ji)肉接頭建(jian)模旨(zhi)在(zai)(zai)建(jian)立一(yi)個支持骨骼肌(ji)細胞(bao)(bao)和運動(dong)神(shen)(shen)經(jing)元在(zai)(zai)同(tong)一(yi)環境中生(sheng)長的(de)體外(wai)系(xi)統。利(li)用(yong)iPSC技(ji)術(shu)，研究(jiu)人(ren)員從(cong)ALS患者和非ALS患者的(de)iPSC中分化(hua)出多種相關(guan)細胞(bao)(bao)類型(xing)。細胞(bao)(bao)在(zai)(zai)單(dan)層培養(yang)中培養(yang)并(bing)(bing)進行表(biao)(biao)征，之后也在(zai)(zai)2D微流控(kong)裝置中研究(jiu)，在(zai)(zai)這(zhe)里觀察到它們能形成神(shen)(shen)經(jing)肌(ji)肉接頭（NMJ），并(bing)(bing)展示出可(ke)量化(hua)的(de)ALS相關(guan)表(biao)(biao)型(xing)差(cha)異。這(zhe)表(biao)(biao)明該(gai)系(xi)統在(zai)(zai)ALS研究(jiu)和藥物發現中具有潛在(zai)(zai)應(ying)用(yong)價值。

一、iPSCs細胞株信息--來自漸凍癥供者和未受影響供者

iPSCs細胞株信息--來自漸凍癥供者和未受影響供者

二、人iPSC衍生的運動神經元表征

根據Axol公司獨特的(de)方法，從ALS患(huan)者和健康供體的(de)iPSC中生成(cheng)了運動神經元前體細胞(bao)。

? 通過免疫組(zu)化(hua)（ICC）檢測這些細胞，分析它們是否表(biao)達運動神經元相關的標志(zhi)物(wu)，檢測時間(jian)是在解凍和成熟后的第10天。

? 使用萊卡成像系統和FIJI軟件對細胞標志物的(de)信號進行量化，結果(guo)如下：Tuj-1 = 100%，HB9 ≥ 80%，Chat ≥ 90%，Isl-1 ≥ 80%。

? 這些細胞還通過多電(dian)(dian)極陣(zhen)列（MEA）進一(yi)步(bu)表(biao)征，結果(guo)顯(xian)示它們具有自發和同(tong)步(bu)的爆發性放電(dian)(dian)活動。

axoCells人誘導多能干細胞衍生的運動神經元的免疫細胞化學染色（未受影響的供體）

圖1.axoCells人誘導(dao)多(duo)能(neng)干細(xi)胞(bao)衍生的運動(dong)神經元的免(mian)疫細(xi)胞(bao)化學染色（未受影(ying)響(xiang)的供體）

三、iPSC衍生的運動神經元中ALS相關功能表型

從解凍后第10天開始，iPSC衍生的運動神經元通過成像和MEA分析，展示了不同的功能和形態表型

圖2.從解凍(dong)后(hou)第(di)10天(tian)開始(shi)，iPSC衍生的運動(dong)神經(jing)元通過成像和MEA分析，展示了不同的功能(neng)和形態表型

四、人iPSC衍生肌管表征

肌管(guan)是通過人iPSC生成的(de)肌母細胞前體(ti)。

? 第5天，使用(yong)免疫組化（ICC）檢測骨骼肌細(xi)胞的特定標志物(wu)，并使用(yong)萊卡成像系統和(he)FIJI軟件對細(xi)胞標志物(wu)進行(xing)量化。

? Actin ≥ 80%，Titin ≥ 80%，MyoD1 ≤ 10%，Myosin-HC ≥ 50%，Myogenin ≥ 50%，Dystrophin ≥ 80%。

? 肌(ji)管(guan)是多核(he)的（每個(ge)核(he)有(you)4-5個(ge)核(he)），并顯示(shi)出明顯的肌(ji)節(jie)結構，表明其為肌(ji)管(guan)/骨骼肌(ji)形態。

人iPSC衍生的肌管

圖3.人iPSC衍生的肌(ji)管(guan)（unaffected donor）

五、在一個與MEA兼容的雙腔微流控系統中建模神經肌肉接頭（NMJ）

成功在NETRI Dualink雙腔微流控系統中建立了iPSC來源的運動神經元和肌管培養體系，并且該系統還能夠進行成像和MEA分析

圖(tu)4.成(cheng)功在NETRI Dualink雙腔(qiang)微流控系(xi)統中建立了iPSC來源(yuan)的(de)運動神經元(yuan)和肌管培養(yang)體系(xi)，并(bing)且該系(xi)統還能夠進行成(cheng)像和MEA分析。

NETRI的DuaLink chip，專為共培養(yang)最多2種細胞(bao)類型和(he)流(liu)體隔離而設計，如:運動神(shen)經(jing)(jing)元(yuan)和(he)骨骼肌(ji)細胞(bao)、皮膚角質形成(cheng)細胞(bao)和(he)感覺神(shen)經(jing)(jing)元(yuan)。其微通(tong)道(dao)技術可(ke)增降軸突投射(she)，將神(shen)經(jing)(jing)突觸與神(shen)經(jing)(jing)元(yuan)胞(bao)體準確區分。Dualink chip 通(tong)量較高(gao)，一整塊板可(ke)培養(yang)16組(zu)樣本，并可(ke)選配(pei)MEA 來記錄神(shen)經(jing)(jing)元(yuan)的電活動。

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六、NETRI DuaLink在第15天的共聚焦圖像

? 通道1：白色–阿爾法毒(du)蛇(she)毒(du)素（NMJ突觸標記/Titin（肌管））

? 通道2：Tuj1（神經突起標記）

? 通道3：ChAt（運(yun)動(dong)神經元標記）/ Tuj1

神經突在通道和微通道中穿過，并進入骨骼肌區域（Tuj1表達呈紅色）

圖6.神經(jing)突在(zai)通(tong)道和微通(tong)道中(zhong)穿過，并進(jin)入骨骼肌區域(yu)（Tuj1 表達呈紅(hong)色）

七、通過α-毒蛇毒素陽性測定NMJ功能性突觸

在20倍放大圖中，白色小點表示后突觸的乙酰膽堿受體α-毒蛇毒素，顯示了肌肉和運動神經元的關鍵功能性神經支配，并且具有功能性的乙酰膽堿神經肌肉接頭（NMJ）突觸

圖(tu)7.在20倍放(fang)大圖(tu)中，白(bai)色小點(dian)表(biao)示后突(tu)觸(chu)的(de)乙(yi)酰(xian)膽堿受體α-毒(du)(du)蛇(she)毒(du)(du)素，顯示了肌(ji)(ji)肉(rou)和(he)運動神(shen)經(jing)元的(de)關鍵功能性神(shen)經(jing)支配，并且具有功能性的(de)乙(yi)酰(xian)膽堿神(shen)經(jing)肌(ji)(ji)肉(rou)接頭(tou)（NMJ）突(tu)觸(chu)。

八、模型中ALS及其他已知遺傳興趣靶標

針對多種疾病類型當前臨床已知的藥物靶標，進行神經肌肉接頭及其組件的TempoSeq或RNASeq分析

圖8.針(zhen)對(dui)多(duo)(duo)種疾(ji)病(bing)(bing)類型(xing)當前(qian)臨床已(yi)知的藥物靶標(biao)，進行(xing)神(shen)經肌肉接(jie)頭及其組(zu)件的TempoSeq或RNASeq分(fen)析。此圖突出了該模(mo)型(xing)在多(duo)(duo)種疾(ji)病(bing)(bing)靶標(biao)（包括(kuo)ALS）中的相關性。

九、在ALS神經肌肉接頭模型中觀察到的超興奮性

來自神經肌肉接頭模型(xing)的MEA分(fen)析(xi)顯示，C9orf72運動神經元(yuan)呈現出可識別的“超興奮性”表(biao)型(xing)。

數據誤差條表示標準誤差（SEM），基于2個芯片上24個生物學獨立重復進行肌管引起的收縮性測量

圖9右上圖 - 概念驗證模型(xing)，數據誤差條表示標準誤差（SEM），基(ji)于2個(ge)芯片上24個(ge)生物學獨(du)立重復進行肌(ji)管引(yin)起的收縮(suo)性測(ce)量(liang)。綠色(se)區(qu)域(yu)（Myotubes）：肌(ji)管（分化的骨骼肌(ji)細(xi)胞(bao)，模擬(ni)肌(ji)肉），標注 “Recording area”（電生理(li)記錄區(qu)）；黃色(se)區(qu)域(yu)（Motor neurons and neurites）：運動神(shen)經(jing)元(yuan)及其軸(zhou)突（模擬(ni)神(shen)經(jing)）；邏輯(ji)：構建神(shen)經(jing) - 肌(ji)肉共培養(yang)模型(xing)，研究運動神(shen)經(jing)元(yuan)對(dui)肌(ji)管的激(ji)活能力。

圖(tu)9a-b. Rasta圖(tu)展示(shi)了由(you)運動(dong)神經(jing)元(yuan)活(huo)動(dong)驅動(dong)的肌管(guan)收(shou)縮性(xing)(xing)。紅色波形(xing)代表肌管(guan)收(shou)縮的電活(huo)動(dong)信號，對(dui)比(bi)突(tu)變型與對(dui)照的信號差異（如突(tu)變組信號更(geng)頻繁 / 更(geng)強）。C9orf72模型相較(jiao)于未受影響的模型，觀察到活(huo)動(dong)增加和(he)長時間收(shou)縮事件。圖(tu)9c. 在單個(ge)電極(ji)水(shui)平上(shang)評估肌管(guan)收(shou)縮性(xing)(xing)，C9orf72突(tu)變組（紫色點(dian)）的收(shou)縮事件遠多(duo)于對(dui)照（Unaffected，彩色點(dian)），提示(shi)突(tu)變運動(dong)神經(jing)元(yuan)更(geng)易激活(huo)肌管(guan)。圖(tu)9d. 通過(guo)雙(shuang)向(xiang)方差分(fen)(fen)析(xi)(xi)（2-way Anova）進行統計分(fen)(fen)析(xi)(xi)。紫色柱明顯高于藍色柱（**，P<0.01），證明突(tu)變運動(dong)神經(jing)元(yuan)對(dui)肌管(guan)的激活(huo)能力更(geng)強。圖(tu)9e. 通過(guo)T檢(jian)驗(yan)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，確(que)定未受影響組與C9orf72 ALS群體數據的均值(zhi)存在差異。

十、結論

? 結合iPSC技(ji)術、微流控技(ji)術和(he)MEA技(ji)術，研究人員能夠(gou)創建一個功能性的神經(jing)肌(ji)肉接頭（NMJ）模(mo)型(xing)，這對ALS的研究和(he)藥(yao)物開發具(ju)有重(zhong)要意義。

? Axol提供的iPSC來源的細胞，在(zai)單(dan)一培養條件下(xia)和雙腔(qiang)微(wei)流控環境(jing)中都(dou)能表現(xian)出預期的標記物(wu)表達和正常功能。

? 在(zai)MEA分析中，研究人員能夠量化運(yun)動神經(jing)元驅動的(de)肌(ji)肉收(shou)縮(suo)，并且在(zai)C9orf72模(mo)型(xing)(xing)中觀察到了超興奮性現象，相較于未受(shou)影響的(de)供體(ti)模(mo)型(xing)(xing)，這種現象更(geng)為明顯。

? 這類模型不僅適用(yong)于ALS的研究(jiu)，還可以擴展到較廣(guang)的疾病靶點研究(jiu)中。

Axol Bioscience是家iPSC技術公司，專(zhuan)注(zhu)于支(zhi)持藥物發(fa)現的advanced模型，特(te)別(bie)是神經(jing)退行性疾病(bing)、神經(jing)炎癥和心臟(zang)毒性領域(yu)的研究。

iPSC產品及服務提供商AxolBioscience

作(zuo)為(wei)iPSC產(chan)(chan)品和服務(wu)提(ti)供(gong)商， Axol Bioscience致力于開(kai)發(fa)更具人類相(xiang)關性的(de)(de)(de)(de)(de)體外模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)，推動更安全(quan)、更有(you)效的(de)(de)(de)(de)(de)療法。憑借超過(guo)十年(nian)的(de)(de)(de)(de)(de)經驗，Axol Bioscience為(wei)全(quan)球前20的(de)(de)(de)(de)(de)生物制(zhi)藥(yao)機構和藥(yao)物研發(fa)公司提(ti)供(gong)高質(zhi)量的(de)(de)(de)(de)(de)體外模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)和定制(zhi)實驗室服務(wu)。 Axol Bioscience的(de)(de)(de)(de)(de)技術(shu)不僅支(zhi)持體外疾(ji)病模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)研究，還提(ti)供(gong)用(yong)于器官芯(xin)片和微流(liu)控系統的(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)量產(chan)(chan)，從簡單的(de)(de)(de)(de)(de)單細(xi)胞(bao)培養模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)到復雜(za)的(de)(de)(de)(de)(de)共培養、三培及(ji)3D模(mo)(mo)(mo)型(xing)(xing)，持續推動iPSC在藥(yao)物發(fa)現中的(de)(de)(de)(de)(de)創新(xin)應用(yong)。